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供体细胞重编程不完全是体细胞克隆效率低的主要原因,包括DNA甲基化、印记基因表达、X染色体失活、组蛋白修饰等方面。为此,本研究拟探讨雌雄体细胞克隆(SCNT)胚胎的发育、DNA甲基化及其甲基化转移酶、组蛋白H3K9甲基化的差异,以及印记基因Xist、H19、IGF2的甲基化和表达水平,并通过降低H3K9me3和Xist的表达,以期提高克隆效率。研究结果如下:1.水牛成纤维细胞性别对SCNT胚胎发育的影响比较雌雄SCNT胚胎发育潜能和速度的结果显示,SCNT-♀胚胎的囊胚率显著高于SCNT-♂胚胎(P<0.05),与来自于X、Y精子的单精子胞质内注射胚胎(ICSI-X和ICSI-Y)及体外受精(IVF)胚胎相比差异不显著(P>0.05)。此外,SCNT-♀和SCNT-♂胚胎的发育速度快于IVF胚胎,,SCNT-♀、SCNT-♂的8细胞率(48h)和囊胚率(120h)显著高于IVF组(P<0.05)。QRT-PCR检测OCT4、SOX2、NANOG在各类胚胎的表达结果显示:SCNT-♀桑椹胚的OCT4和NANOG以及囊胚期NANOG表达量显著高于SCNT-♂组(P<0.05),而SCNT-♂囊胚期OCT4的表达量显著高于SCNT-♀组(P<0.05),SOX2在SCNT-♀和SCNT-♂的桑椹胚和囊胚的表达差异不显著(P>0.05)。2.雌雄水牛克隆胚胎甲基化差异的研究比较雌雄SCNT胚胎DNA甲基化及其甲基化转移酶和H3K9me2、H3K9me3的表达水平,探讨SCNT胚胎甲基化差异的分子机制。采用免疫组化检测 5mC、5hmC 以及 H3K9me2、H3K9me3 的表达;QRT-PCR 分析 Dnmts和TETs mRNA的表达水平。结果显示:5mC、5hmC分别主要表达于SCNT-♀、SCNT-♂胚胎,且SCNT-♀胚胎甲基化水平低于SCNT-♂胚胎;而DnmtN、Dnmt3a和Dnmt3b在SCNT-♀和ICSI-X早期胚胎的表达差异不显著(P>0.05),但在SCNT-♂和ICSI-Y早期胚胎的表达差异显著(P<0.05)。TET1高表达于SCNT-♂胚胎;TET2和TET3在早期胚胎低表达。H3K9me2高表达于IVF胚胎;H3K9me3显著高表达于SCNT-♂的8cell期(P<0.05)。3.雌雄克隆胚胎印记基因的甲基化模式及调控研究采用重亚硫酸盐结合PCR法(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)检测Xist、H19、IGF2在雌雄克隆胚胎和来自于X、Y精子的IVF-X、IVF-Y胚胎的甲基化状态。结果显示:Xist的甲基化水平在IVF-X、IVF-Y胚胎分别为44.8%和72.3%,在SCNT-♀胚胎甲基化状态类似IVF-X胚胎,但在SCNT-♂胚胎甲基化水平为0%。H19和IGF2在这四组早期胚胎的甲基化水平变化为80%-94%。KDM4B显著降低雌雄SCNT胚胎H3K9me3的表达且提高SCNT-♂胚胎的分裂率、囊胚率和SCNT-♀胚胎的分裂率(P<0.05)。4.雌雄水牛克隆胚胎印记基因的表达和调控QRT-PCR 检测 Xist、H19、IGF2 在 ICSI-X、ICSI-Y、SCNT-♀、♀CNT-♂早期胚胎的表达情况。Xist-shRNA降低SCNT-♀胚胎Xist的表达以期提高克隆胚胎发育潜能。结果发现:Xist高表达于各类胚胎的8cell(P<0.05),在各时期SCNT-♀胚胎的表达高于SCNT-♂胚胎(P<0.05);H19、IGF2高表达于SCNT的2cell和8cell(P<0.05)。Xist-shRNA显著降低SCNT-♀胚胎的Xist的表达及其囊胚率(P<0.05)。5.雌雄克隆水牛印记基因的甲基化和表达情况采用BSP法和QRT-PCR法分别检测印记基因Xist、H19、IGF2在雌雄的存活(♀LI-3,♂LI-3)、死亡克隆水牛(♀S1-3,♂S1-3)和普通水牛(♀N1-3,♂N1-3)耳部的甲基化和表达情况。结果显示:(1)Xist基因甲基化水平在♀L组的与♀N组差异不显著(P>0.05),而♀S组显著低于♀N组(P<0.05);在♂L、♂S和♂N组差异不显著(P>0.05)。(2)H19的甲基化水平在♀L、♀S和♀N以及♂L、♂S和♂N组差异不显著(P>0.05)。IGF2的甲基化水平在♀L、♀S和♀N以及♂L和♂N组差异不显著(P>0.05)。但♂S组显著低于♂L和♂N组(P<0.05)。(3)Xist的表达水平在♀S组显著高于♀L和♀N组(P<0.05),但♂S、♂L和♂N组无显著差异(P>0.05);而H19、IGF2在♀L和♀N以及♂L和♂N组无显著差异(P>0.05),但在♀S和♂S组分别显著高于♀L、♀N以及♂L、♂N组(P<0.05)。上述结果表明:(1)SCNT-♀胚胎的发育潜能高于SCNT-♂胚胎;(2)SCNT-♀胚胎的DNA甲基化水平低于SCNT-♂胚胎,且其Dnmts的转录模式和Xist的甲基化较于SCNT-♂胚胎趋于正常;(3)抑制H3K9me3的表达,促进SCNT胚胎的发育;(4)抑制Xist的表达,促进SCNT-♀胚胎的发育;(5)Xist、H19和IGF2的甲基化和表达水平在存活克隆水牛正常,在死亡克隆水牛低甲基化和高表达。