论文部分内容阅读
斯钙素1(STC-1)是一种糖蛋白激素,在哺乳动物体内的多种器官组织都有分布与表达,属于多效因子。STC-1可以通过肠道与肾脏调节钙磷代谢。在肾脏中,主要是通过抑制钙的吸收,同时增加磷的重吸收来调节钙磷稳态。在多种细胞组织中的研究表明,STC-1还具有抗凋亡的作用,分子机制尚存在争议。镉是一种有蓄积性毒性的重金属元素。人的镉中毒已经受到普遍关注,然而对哺乳动物的镉中毒研究还很缺乏。与人相比,哺乳动物的镉中毒具有高耐受性和隐蔽性的特点。镉的主要蓄积部位是动物肾脏并引起肾脏损伤。因此,研究镉作用细胞后,STC-1在其中的相关作用,为STC-1功能研究提供参考,另外,研究STC-1对镉诱导牛肾细胞(MDBK细胞)的作用还可以有助于保障哺乳动物健康和规范动物食品安全检测。本实验对牛肾细胞(MDBK细胞)进行培养,在细胞对数生长期添加氯化镉处理,通过荧光定量PCR与Western-Blot方法对STC-1的基因与蛋白的表达量进行测定。通过添加定量氯化镉和不同浓度的人斯钙素(h STC-1)重组蛋白处理细胞,检测凋亡基因Caspase3、Bcl-2和解偶联蛋白2(UCP-2)的m RNA表达量变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率和活性氧(ROS)产生量,结果如下:1.镉对牛肾细胞STC-1 m RNA和蛋白表达的影响通过不同浓度的镉处理细胞:STC-1基因有不同程度的上调并具有明显的剂量与时间依赖性。2h后,STC-1表现为上调显著,其中,20μg/m L镉诱导细胞8h后,与对照组相比,STC-1基因表达量是对照组的53倍,差异极显著,即(P<0.01),30μg/m L和50μg/m L组上调26和16倍,差异显著(P<0.05)。通过定量镉处理细胞:STC-1蛋白表达量上调明显并随时间延长上调越明显,2h组、4h组、8h组和12h组与对照组相比STC-1蛋白上调1.6、17、26.1和26.2倍。2.h STC-1重组蛋白对镉诱导的细胞凋亡过程的影响通过定量镉与不同浓度h STC-1重组蛋白共同处理细胞:有h STC-1重组蛋白共同处理的实验组与只有定量镉处理的对照组相比,Caspase-3、Bcl-2和UCP-2基因有明显的表达量变化。实验组的Caspase-3表现为下调,其中,4h后,0.5μM和2μM组基因下调为对照组的0.11和0.18倍,差异显著,即(P<0.05),8h后,0.5μM和2μM组基因下调为对照组的0.13和0.24倍,差异显著,即(P<0.05)。实验组的Bcl-2表现为上调,其中,2h后,0.5μM组基因上调为对照组的3.2倍,差异显著,即(P<0.05),4h后,0.5μM组基因上调为对照组的2.4倍,差异显著,即(P<0.05)。实验组的UCP-2表现为上调,2μM组基因上调为对照组的1.9倍,差异显著,即(P<0.05),8h后,0.5μM组基因上调为对照组的3倍,差异显著,即(P<0.05)。因此,h STC-1重组蛋白在镉诱导细胞凋亡过程中,早期上调Bcl-2和UCP-2明显,晚期下调Caspase-3明显,作用浓度为0.5μM-2μM。通过定量镉与不同浓度h STC-1重组蛋白共同处理细胞:0.5、2、10μM h STC-1重组蛋白处理的实验组的早期凋亡率分别为8.39%、4.23%和4.64%,细胞ROS产生量的平均值分别为9.88、3.53和8.58,与对照组早期凋亡率13.95%和ROS产生量的平均值19.8相比,说明h STC-1重组蛋白可以明显抑制凋亡与ROS产生,作用浓度2μM-10μM。结论:镉诱导细胞凋亡中STC-1基因蛋白表达上调显著,提示可以参考STC-1表达量来判断镉的蓄积情况。h STC-1重组蛋白可以有效抑制镉诱导的细胞凋亡,分子机制包括凋亡早期Bcl-2表达和UCP-2基因的表达,凋亡晚期时抑制促凋亡基因Caspase-3表达并抑制ROS的产生。本实验为进一步研究STC-1生物功能提供参照。