[目的]半导体纳米粒子-量子点(Quantum dot,Qdot)是一种新型的纳米材料,其半径小于或接近于激子玻尔半径的纳米微粒,又称半导体纳米晶(semiconductor nanocrystal) (1)。量子点一直是材料、电子、物理等学科领域的研究热点,近年来由于其具有独特的光谱特征、良好的生物相容性,加上可适应性和高通量的分子识别等特性,在生命科学的多个领域取得了突破性的进展(2-5)。量子点优越的荧光特性使之可以用于荧光标记进而成为一类理想的生物荧光探针。在生物医学领域,量子点的具体应用主要在于：可以在细胞水平成像,观察细胞器的各种状态(5);可以进行生物分子多组分的测定,对干扰的杂质分子有很好的消除作用;可以对多种蛋白质进行标记，从而检测蛋白质与蛋白质之间的相互作用等等。当然量子点在生物体系中的应用远不止这些,它还可以应用于生物芯片、溶液矩阵、医学成像等方面(6)。可以看到,量子点的生物学应用基本上都是基于量子点对生物细胞无害的假设上面。目前关于量子点的生物学效应以及其药代动力学和毒理学的研究还处于起步阶段,文献报道也主要是一些观察性报道,如观测量子点在静脉注射后位于体内的分布(7,8)以及不同包被修饰后量子点的代谢情况。但是,在分子水平上量子点是否对细胞的生理功能产生影响,尤其是对人体细胞的影响如何则更是值得人们关注的。一个化合物对细胞在分子水平的影响可从其对细胞中最重要的两大类物质即蛋白质和DNA的影响来研究。对DNA的干扰是许多化合物导致细胞生理功能改变的主要途径,如对碱基的修饰,造成DNA单链断裂(single strand breaks, SSBs),双链断裂(double strand breaks, DSBs),链间或链内的交联(cross-link)等。由于对DNA的损伤可影响到遗传性状的改变,因此这种DNA损伤功能的特性被称为“遗传毒性”。在各种DNA损伤中,DSBs被认为是最严重的一种。研究发现,细胞在受到DNA损伤尤其是DNA双链断裂损伤后,在DNA双链断裂位点会发生一种H2AX蛋白的磷酸化。作为与真核细胞DNA相结合的组蛋白成分,H2AX的C端结构域中含有一个Ser残基,当DSBs出现时,该残基被磷酸化(称为γH2AX)。γH2AX进一步募集其它DNA损伤修复相关蛋白到损伤位点,形成“焦点”结构,对DNA损伤进行感受和修复,因此是细胞应激反应中的重要成员。由于γyH2AX的出现与DSBs紧密相关,γH2AX成为检测细胞DNA损伤的一个新的特异性指标。一些有研究显示,以镉硒或者镉碲为核心的量子点毒性部分来源于在溶液中游离的镉元素或者进入细胞后释放的镉元素(9,10)。另一方面,以镉硒或者镉碲为材料的量子点具有光致氧化和空气致氧化性,由此产生的自由基可能成为量子点毒性产生的又一大机制。为了增加量子点的稳定性,拓宽其应用范围以及减小核心材料的副作用,研究人员在镉硒或者镉碲量子点外层加上不同的包裹材料,以期减少可能的镉元素释放以及增加生物兼容性。ZnS是比较普遍应用的材料之一。它可以改善因为镉硒碲等元素未满电子层轨道所致的不稳定性,从而增强荧光效率(11)。合成之初,量子点亲水性较差,研究人员通过运用巯基丙酸(mercaptopropionic acid)和多聚乙二醇(polyethylene glycol) (PEG)来增加量子点的水溶性并防止纳米颗粒的聚集(6)。鉴于以上原因,我们拟对量子点的细胞毒性和遗传毒性进行深入研究。本课题选用人皮肤成纤维细胞(HSF)为靶细胞,分别检测CdSe QDs以及有PEG包被的CdSe QDs对HSF细胞的细胞毒性作用;选用γH2AX为检测指标,运用免疫荧光技术研究这两种材料对HSF细胞的DNA损伤作用;通过彗星实验进一步验证材料的遗传毒性作用。使用荧光探针DCF检测ROS水平,探讨其在DNA损伤中的作用。为量子点对人皮肤成纤维细胞的影响提供毒理学依据以及探讨其相应的机制。[方法]1、细胞培养和量子点处理：HSF细胞培养于10%小牛血清、0.03% L-谷氨酰胺、104 U·L-1青霉素、125 mg·L-1链霉素的α-MEM培养基中。细胞传代培养至对数生长期时,分别加入量子点440、680,使每组培养液中量子点终浓度分别达到8 nM和80 nM,于37℃,5%C02继续培养2、8和24 h。对照组用相同体积的等量PBS处理细胞。2、细胞毒性实验1)MTS比色法：用96孔板,分别用量子点440和680进行2,8和24 h处理,每板内分为空白组(未经量子点处理)、量子点8 nM、80 nM处理组、试剂对照。细胞分别培养到相应的处理时间点后,加5g·L-1 MTS 20μl,37℃条件下继续孵育45分钟,终止培养。选择490波长,在酶标仪上测定各孔光吸收值(A 490)。2)台盼兰计数实验：取75μl混有细胞的培养液,用75μl稀释浓度为0.4%的台盼兰与之混匀,取50μl混合液,滴于计数板上,于显微镜下观察计数。3、γH2AX检测’1)免疫荧光：用量子点处理细胞不同时间点后通过免疫荧光手段检测yH2AX在细胞核内分布情况。2) Western blot:量子点处理后的细胞用western blotting实验检测γH2AX蛋白的表达情况。4、彗星实验：细胞用量子点处理结束后,离心收集,调节细胞浓度至6×1010L-1。制备“三明治”凝胶。依次进行裂解、25V电泳、DAPI染色,在荧光显微镜下观察结果。5、ROS机理检测：在细胞处理结束后,用0.25%胰酶消化后,PBS重悬,加入DCFH-DA调至工作液浓度(20μM),避光孵育30 min后,用酶标仪在激发波485 nm处进行检测。6、双向电泳：HSF细胞用PEG包裹的量子点在8 nM或80 nM处理24小时后,提取蛋白进行双向电泳。[结果]1、无PEG包裹的量子点680在80 nM浓度下作用24小时显著影响细胞生存率。MTS实验显示,用有PEG包裹的量子点680和440在8 nM和80 nM条件下处理细胞24小时,细胞与对照组无显著差异。而没有PEG包裹的这两种量子点在高浓度下作用于细胞8小时后开始显示出对细胞生存率的负面作用。台盼蓝实验进一步表明8 nM浓度下没有PEG修饰的量子点680和440在24小时观察时间内对HSF细胞几乎没有影响;而量子点680在高剂量情况下显示出细胞毒性,活细胞数量显著降低。2、未经PEG修饰的量子点在高浓度剂量下可引起γH2AX焦点形成。γH2AX焦点是检测DNA损伤的敏感指标之一。免疫荧光实验结果显示量子点440和680在有PEG包裹的情况下在24小时内形成的γH2AX焦点与阴性对照组相比并没有明显区别。而暴露于高剂量量子点下的HSF出现γH2AX焦点的数量呈现出时间依赖性。Westernblot同时验证了这种趋势。3、中性彗星实验表明无PEG修饰的量子点可引起DNA双键断裂。4、ROS是量子点引起γH2AX焦点的原因之一。5、有PEG修饰的量子点440和680对于蛋白表达水平的改变几乎没有影响。[结论]1、PEG是较好的减少量子点细胞毒性的材料2、无PEG包裹的量子点可引起DNA损伤,具体表现在γH2AX焦点形成以及DNA双键断裂。;3、氧化应激是造成无PEG修饰的量子材料毒性的原因之一。