内蛋白子(intein)是一种能够进行蛋白剪切和再连接的特殊蛋白。通常intein由具有自我剪接活性的N端和C端部分以及中间的归巢内切酶(homing endonuclease)部分构成。内蛋白子末端剪接点氨基酸十分保守：N端通常为Cys，Thr或Ser，而C端是Asn或Gln。归巢内切酶可识别dsDNA上内蛋白子在外蛋白子基因上的插入位点，介导内蛋白子序列在基因中移动，所谓内蛋白子的归巢。没有归巢内切酶部分的intein称为微内蛋白子(mini-intein)，它仍然保留了intein的蛋白剪切和再连接活性，但失去了归巢内切酶功能。　　 本研究中运用的Split Ssp DnaB mini-intein是由蓝细菌Synechocystis sp.PCC6803的DnaB intein经基因重组构建的，该构建将ssp DnaB intein N端的106个氨基酸部分(ID)和C端48个氨基酸部分(Ic)位置前后调换，形成Split mini-intein结构，在这两个元件间插入外源蛋白不仅会被剪切，而且可以通过首尾连接成环。因此，Split mini-intein也可用于合成环肽。　　 相对于线性小肽，环肽由于空间构象的限制，结构更稳定，能更紧密地结合于生物大分子，在结合时环肽的构象改变而引起的熵值的改变较小，并且环肽对于蛋白酶水解的敏感性降低。因此，具有更好的开发价值。但环肽的合成方法研究不多，近年来，Intein自我剪切现象的发现及其自我剪接反应机理的阐明，为生物法合成环肽提供了有效方法。　　 本研究利用Split Ssp DnaB mini-intein在E. coli BL21中构建一个六肽的环肽库。采用人工合成的编码随机六肽序列的寡核苷酸链，体外退火延伸，将得到的DNA片段混合物克隆至表达载体pVmut，用连接产物转化E. coil BL21，获得一个有2000多克隆的转化子库。随机挑选4个克隆，测序证明均按正确阅读框插入了不同小肽序列，在37℃诱导表达其中的融合蛋白Split-intein-IS。Western结果证明融合蛋白表达并发生了自我剪接反应。　　 大肠杆菌的IdcA基因编码一个胞内L，D-羧肽酶，ldcA的敲除可以使大肠杆菌生长到稳定期时发生自溶。PCR扩增IdcA上下游片段，构建上下游片段中插入卡那抗性基因(kanr)的敲除载体pKUD，转化E.coli BL21，筛选发生双交换的ldcA敲除突变株。取进入稳定生长期的E.coli BL21观察，发现细胞自溶。为在体外筛选小分子环肽生物活性创造了条件。