利用大型真菌进行土壤重金属污染修复是环境修复研究中一项新颖的生物修复技术,其中重金属超富集大型真菌的筛选是该技术的关键和核心。运用超富集大型真菌来治理重金属污染土壤、利用基因工程手段创新超富集大型真菌种质,首先需要明确超富集大型真菌吸收、转运和体内贮存重金属的机理及相关基因。本实验室前期收集了大量易栽培的大型真菌,比较其对锰胁迫的耐受和富集特性差异,从中筛选发现肺形侧耳（Pleurotus pulmonarius（Fr.）Quél,商品名为秀珍菇）菌丝体具有较强的耐受和富集Mn的能力。本研究在此基础上,进一步对肺形侧耳耐受和富集Mn的特性进行了详细分析;利用RNA-seq技术高通量地研究锰胁迫处理下菌丝体转录水平的响应情况,鉴定菌丝体锰胁迫下的差异表达基因,探明锰转运主要涉及的生理过程,筛选响应锰胁迫相关基因;最后克隆了锰胁迫相关关键候选基因PpMTP1,并对其进行了生信分析和初步功能验证。本研究的主要结果如下:1、当培养基中Mn2+浓度≤100 mg/L时,肺形侧耳LD1菌株的菌丝生长未受到明显抑制,菌丝体中锰的含量高达27260 mg/kg（干重）,达到超富集水平;另外4个肺形侧耳菌株（GY18、HZ3、XY秀1和SM）的菌丝体在生长未受到显著抑制时,菌丝体内的锰含量最高分别为20582 mg/kg、15176 mg/kg、19179mg/kg和23952 mg/kg,均达到超富集水平,表明肺形侧耳可能是锰超富集大型真菌。而在肺形侧耳子实体中锰的含量未达到超富集水平。随Mn2+处理时间的延长,肺形侧耳菌丝体中锰的含量增加,72 h达到最高（37510 mg/kg）,72小时后有所下降并趋于稳定。2、对锰胁迫处理（100 mg/L锰处理6 h、12 h、5 d）和对照（0 mg/L锰处理）的菌丝体进行转录组测序,共得到30 GB的数据,每个样本数据量均在2.03 GB以上,Q30≥88.96%,与参考基因组的比对率在83.18%到86.80%之间。锰胁迫下差异表达基因主要富集在氨基酸代谢、脂肪酸代谢、有机酸代谢、糖代谢及次生代谢产物的合成等代谢途径,其中氨基糖和核苷酸糖代谢及脂肪酸分解代谢途径值得关注。筛选到可能响应锰胁迫并且表达量相对较高的15个基因,涉及CDF/MTP、NRAMP、ZIP、P-TYPE ATPASE等基因家族以及过氧化物酶、超氧化物歧化酶、漆酶等基因。3、锰胁迫处理后,转录本gene-EYR40＿008542显著上调表达,且表达量相对较高,推测其可能与锰的吸收和转运相关。经生物信息学分析,gene-EYR40＿008542符合CDF/MTP家族的特征,暂将其命名为PpMTP1,并成功将其克隆。利用q RT-PCR技术检测PpMTP1对锰胁迫处理的响应规律,发现在锰处理（100 mg/L）条件下,随着处理时间的延长,PpMTP1的表达量先升高再降低,再升高再降低,在6 h和5 d时出现两个峰值,分别为对照的81倍和34倍,于10 d之后稳定在与对照无显著差异的水平。拟南芥原生质体和烟草叶片细胞瞬时表达表明,PpMTP1定位在质膜上。酵母突变体功能互补实验结果表明,PpMTP1能恢复锰敏感突变体Δpmr1的耐锰能力。上述实验结果表明,PpMTP1可能是一个定位在质膜上负责Mn2+转运的基因。综上所述,本研究筛选到了一株潜在的锰超富集大型真菌——肺形侧耳,研究了其菌丝体的锰富集特性,并在转录水平上对肺形侧耳菌丝体响应高锰胁迫的分子机制进行了分析,初步验证了响应锰胁迫的关键候选基因PpMTP1的功能。该研究将为全面揭示肺形侧耳响应高锰胁迫的分子机制奠定基础,为利用基因工程手段进行超富集大型真菌种质创新提供了基因素材。