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随着转基因作物日益广泛的应用和功能基因的不断发掘,无论从基础研究还是应用开发角度都对基因操作提出了更高的要求,不仅要完成单基因的转化,而且能够高效、方便、快速地实现多基因转化。因此,多基因转化方法的研究成为植物基因工程研究新的热点。本研究利用连接肽(linker)2A和LP4/2A,将两个报告基因gus(葡萄糖醛酸酶)、gfp(绿色荧光蛋白)和一个筛选标记基因hpt (潮霉素磷酸转移酶基因)连接,构建多基因融合表达载体,将融合基因表达载体转化玉米,利用玉米瞬时表达体系与稳定表达体系分析连接肽(linker)的剪切功能,同时分析外源基因在连接肽的前后位置对其表达量的影响。首先利用重叠PCR技术及DNA克隆技术构建了四个融合基因表达载体:p35PASAT、p35SAPAT、p35PLASLAT、p35SLAPLAT和两个对照载体:pPT、pST。其中p35PASAT、p35PLASLAT为gfp基因在前,gus基因在后,hpt基因在最后,前者以2A为连接肽,后者以LP4/2A为连接肽;p35SAPAT、p35SLAPLAT为gus基因在前,gfp基因在后,hpt基因在最后,前者以2A为连接肽,后者以LP4/2A为连接肽。pPT是GFP表达盒与HPT表达盒直接首尾相连,pST是GUS表达盒与HPT表达盒直接首尾相连。利用基因枪法将构建的六个植物表达载体转入玉米愈伤组织进行瞬时表达分析,RT-PCR结果显示转化的外源融合基因在玉米中正确转录,融合基因在转录水平上是完整的;Western Blot结果表明转基因玉米愈伤组织同时表达有GFP蛋白和GUS蛋白;GUS组织化学分析和GUS荧光定量分析结果表明转p35SAPAT载体的玉米愈伤中GUS蛋白表达量比转p35PASAT的载体的玉米愈伤中GUS蛋白表达量高,转p35SLAPLAT载体的玉米愈伤中GUS蛋白表达量比转p35PLASLAT的载体的玉米愈伤中GUS蛋白表达量高;用2A为连接肽与用LP4/2A为连接肽构建的载体轰击后玉米愈伤的GUS蛋白表达量差别不大。同时利用基因枪法将构建的植物表达载体转化玉米获得转基因植株进行稳定表达分析。通过玉米愈伤的分化再生得到转化植株192株。PCR检测结果表明:gfp、gus、hpt基因整合到了玉米的基因组中;RT-PCR结果显示外源融合基因在玉米体内正确转录,融合基因在转录水平上是完整的;Western Blot结果表明GFP蛋白和GUS蛋白在植物体内正确表达。根据实验结果我们得出结论:利用连接肽进行多基因转化在玉米中是可行的,连接肽LP4/2A和2A都可以用于玉米的多基因转化;基因在连接肽前面时的表达量要高于基因在连接肽后面时的表达量;连接肽LP4/2A和2A的剪切作用发生在翻译水平;用LP4/2A作为连接肽与用2A作为连接肽时蛋白表达量差异不大。