论文部分内容阅读
世界上约20%的可耕种面积受到土壤盐渍化和干旱胁迫的影响,这两种胁迫是作物减产主要的非生物胁迫因素。而新疆盐碱地面积是我国分布最广、土壤积盐最重的地区,占全国盐碱土地面积的22.0%。加工番茄是新疆重要的经济作物之一,为缓解土壤盐碱化对番茄生长发育的影响,除土壤改良外,通过提高加工番茄自身的耐盐性,来缓解盐胁迫对加工番茄生长的影响,是最为经济有效的途径。因此,本试验利用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变加工番茄“JW9”材料来创造突变体,并以耐盐性为选择目标,筛选出耐盐突变体。利用转录组测序技术分析耐盐基因并进行克隆和表达载体的构建,以期利用转基因技术转化拟南芥验证后获得新的耐盐材料。研究结果如下:1、大田种植观察变异类型:以EMS半致死浓度（3.0%）诱变处理1500粒加工番茄种子10 h后单粒播种于穴盘,以清水处理140粒加工番茄种子10 h作为对照。在苗期,EMS处理材料共存活725株,对照全部存活,果实成熟后进行单株留种,处理组共存活并收种592株,对照组几乎全部存活。通过田间调查发现一些主要的变异类型,如植株高大、植株矮小、茎不分枝、植株不开花、茎分枝多、雄性不育、无生长点、晚熟、茎粗大;叶片颜色浅绿、叶片卷缩、大叶片、狭长叶、叶片裂缺;果实乳状突起、果顶开裂、葫芦果、条纹果、畸形果等,M1代番茄总的变异类型为26种,总的变异数为133,变异率为8.87%,其中有益突变为植株高大,增加植株光合产能,结实量大;茎变粗,抗倒性强;植株分枝数增多,结果多;花粉败育,造成番茄雄性不育,为杂种优势提供材料。2、利用PCR-SSCP技术筛选耐盐突变体:将大田种植存活的592株处理组和对照组样本进行采样。提取样本DNA,利用SSCP分子标记技术从50对盐胁迫相关基因引物中检测突变体。结果发现,共筛选出22条条带稳定的引物,592株诱变后的植株中,有17份材料与对照材料存在差异条带,多态性检出率为2.87%,在22对引物中,有6对引物共检测出23个多态性位点,从SSCP技术中筛选出的引物占所有可扩增出条带引物的27.27%,占所有筛选引物的12%。3、转录组测序数据分析及筛选耐盐候选基因:对本实验室前期汪斌等人筛选出的16株耐盐突变植株进行转录组测序,分析结果发现,在测序样本中共筛选出4367个基因为样品间的显著差异表达基因（DEGs）,其中上调表达基因2606个,下调表达基因1761个。这些显著差异表达基因功能主要涉及次级代谢、代谢调控、激素代谢、信号转导和植物病原菌互作等。经qRT-PCR检测表明,10个随机选择的DEGs表达量变化与转录组测序结果一致。通过GO和KEGG通路富集分析,从具有耐盐功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶和ATPase酶合成相关的基因中,找到5个显著差异表达基因包括Solyc08g066270.1和Solyc03g083420.2以及Solyc10g018530.1、Solyc09g082890.1和Solyc02g014190.2可能耐盐相关基因。4、耐盐候选基因克隆:对候选基因进行基因克隆,由转录组测序结果可知其mRNA序列及其大小,利用Blast进行比对后将同源序列相近的基因利用MEGA6找出基因核心序列后利用Primer6设计引物,同时在引物两端加入酶切位点序列。利用提取16株耐盐突变植株总RNA合成的cDNA,进行PCR扩增目的条带并将其克隆到pMD19-T载体进行序列测序验证,检测成功的基因亚克隆至植物过表达载体pCAMBIA2300,构建合适的重组子进行双酶切验证后送测序检验,经测序发现Solyc03g083420.2基因过表达载体构建成功。