黑色素瘤是一种高转移高侵袭性的恶行肿瘤,主要特征是病情进展迅速,易侵袭其他组织器官,诊断率较低,且一旦确诊多属晚期情况。近年来,大量临床前研究和流行病研究结果表明黑色素瘤患者体内血清维生素D水平与肿瘤恶性程度呈正相关,与患者预后生存期呈负相关,且维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）基因的多态性与黑色素瘤的发病率相关。人体皮肤上皮细胞内的胆固醇经紫外线照射后氧化形成活性维生素D前体—7-脱氢胆固醇,运输至肝脏经25-羟化酶催化形成25（OH）D₃,25（OH）D₃经血液运送至肾脏,在1-羟化酶作用下形成具有生物活性的维生素D—1,25（OH）₂D₃,又称为活性维生素D₃（Vitamin D₃,VD₃）。活性VD₃与维生素D受体特异性结合形成VD₃/VDR复合体调控靶基因转录,影响细胞增殖、分化和凋亡等生命活动。但是,VD₃与黑色素瘤发生发展的机制尚未解析。太阳结构域家族蛋白酶2（NOP2/Sun RNA methyltransferase 2,NSUN2）是典型的RNA甲基转移酶,其不仅参与了细胞增殖、细胞分化与迁移等生命过程,而且NSUN2高水平表达与多种肿瘤恶性程度、癌细胞迁移能力正相关,与患者预后负相关。我们前期研究发现,活性VD₃显著抑制黑色素瘤细胞增殖,并降低Nsun2基因表达水平。基于此,我们推测活性VD₃与VDR形成转录复合体,调控Nsun2基因表达,从而发挥抑制黑色素瘤细胞增殖。为了验证上述假设,本课题针对活性VD₃抑制黑色素瘤细胞增殖和迁移机制展开研究。首先,我们比较不同浓度和作用时间的活性VD₃对黑色素瘤细胞增殖能力的影响;分析活性VD₃处理黑色素瘤细胞后Nusn2基因表达水平;应用CRISPR核酸系统靶向敲除黑色素瘤细胞Vdr基因,检测Vdr敲除后补偿活性VD₃对细胞株增殖能力影响;然后,我们构建稳定高效干扰Nsun2基因的黑色素瘤细胞株,分析Nsun2对黑色素瘤细胞增殖和迁移能力影响;进一步利用RNA-seq技术分析干扰Nsun2细胞的基因组表达水平,筛选差异表达基因,富集差异基因的GO和KEGG;最后,我们使用在线软件预测Nsun2基因启动子区维生素D受体结合原件（vitamin D responsive elements,VDRE）,构建不同区段启动子的双荧光素酶报告载体,分析活性VD₃/VDR调控靶基因的潜在结合位点。本研究获得主要实验结果如下:1.活性VD₃特异性抑制黑色素瘤细胞增殖,对黑色素前体细胞无显著影响;100n M活性VD₃处理黑色素瘤细胞72 h后,对细胞增殖和迁移能力抑制率分别达60.6%和44.5%,Western-blot检测结果说明活性VD₃引起黑色素瘤细胞NSUN2蛋白表达水平下降;且利用CRISPR/Cas9核酸酶敲除Vdr基因后补偿活性VD₃促进黑色素瘤细胞增殖。2.基于慢病毒sh RNA载体,干扰Nsun2基因显著抑制黑色素瘤细胞增殖与迁移效率;分析RNA-seq测序数据,差异表达基因的GO主要富集在微管、着丝粒和纺锤体等细胞器,KEGG主要富集在细胞增殖、信号传导和免疫调控等相关通路,其中包括P53,TNF和NF-κB等信号通路。进一步验证干扰Nsun2后细胞周期蛋白抑制因子p21表达量上调,细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases,ERK）表达量下调。3.利用在线软件JASPAR预测小鼠Nsun2基因启动子区存在2个潜在VDRE,分别构建不同区段启动子双荧光素酶报告系统,进一步发现VD₃/VDR复合物与潜在VDRE结合从而抑制荧光素酶报告基因转录。