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星形胶质细胞(Astrocytes,As)是最大的一类神经胶质细胞,在帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)中的作用日益倍增。在PD中,不仅有黑质致密部多巴胺能神经元的大量丢失,还伴有星形胶质细胞的显著活化与增生。β-突触核蛋白(β-synuclein,β-syn)突变体V70M和P123H在神经元细胞内聚集诱导细胞凋亡,加速神经退化。但是β-syn突变体V70M和P123H在星形胶质细胞中表达对神经元退化的影响以及介导PD病理学过程的机制还不清楚。本课题将在稳定表达β-syn V70M和P123H的U251细胞上进行,研究β-syn突变体在星形胶质细胞表达及对神经元的影响,探讨星形胶质细胞源性的β-syn突变体在PD病理进程中的分子机制。在本实验中,我们把构建好的β-syn野生型和两种突变型的质粒,瞬时转染进U251细胞中,应用Western blot方法和免疫荧光标记法,鉴定其能够在细胞内表达。WST-1和LDH实验显示,转染β-syn V70M和P123H的As的存活率显著下降,细胞毒性增加。接下来,通过构建带有Flag标签的β-syn野生型和突变型U251星形胶质细胞瘤细胞的稳转细胞株,我们通过细胞免疫荧光标记法和Western blot的方法,探讨了β-syn突变体在U251的表达对As的影响。把正常的和转染VECT的U251作为对照组,我们发现β-syn的WT在胞内呈弥散分布的状态,β-syn突变体V70M和P123H在U251细胞内出现有聚集体,并且促进了U251细胞内α-syn的聚集,一定程度增加GFAP和S100β的表达,改变了U251细胞内周期与凋亡相关蛋白的表达。我们通过进一步收集β-syn野生型和突变型V70M、P123H的U251稳转细胞的条件性培养液,通过Western blot方法检测As内的β-syn是否能够被释放到细胞外。结果表明,U251细胞内不论是野生型还是突变型的β-syn均能够被释放到胞外。将收集的β-syn野生型和突变型V70M、P123H的U251稳转细胞的条件性培养液,培养SH-SY5Y,通过应用WST-1细胞活性检测法、细胞免疫荧光法、蛋白免疫印迹法和TUNEL检测细胞凋亡法,观察突变的β-syn在As中的表达对神经元的影响。实验结果证明,稳定表达β-syn V70M和P123H的U251细胞条件性培养液,显著降低了SH-SY5Y的细胞存活率,增加了α-syn的表达,促进caspase3和p53凋亡相关蛋白的表达,导致细胞的凋亡率上升,并减短了轴突长度。随后我们将带有Flag标签的β-syn野生型和突变型V70M、P123H的U251稳转细胞和SH-SY5Y直接混合共培养,研究星形胶质源性的β-syn能否转移至神经元内。免疫荧光标记发现,星形胶质源性的β-syn能够被神经元细胞摄取到细胞内。最后我们通过同源重组,采用Cre和Loxp系统,构建星形胶质细胞特异敲进β-syn V70M基因的转基因小鼠,经过体重、步距、悬尾等一系列的行为学实验检测发现,转基因小鼠的行为学发生异常变化,并伴有抑郁焦虑症状的产生。Western blot方法检测各脑区蛋白表达,发现α-syn和S100β的表达增加异常。总之,β-syn突变体V70M和P123H在As内会形成聚集,加剧α-syn的聚集,导致As活化,降低细胞活性,增加细胞毒性,促进S100β表达,进而导致神经元内α-syn聚集,诱发神经元凋亡,促进神经退化,并且神经元细胞能够摄取星形胶质源性的β-syn,As内特异敲进的β-syn V70M基因打靶小鼠出现行为学障碍。这些结果表明路易体痴呆相关蛋白β-syn突变体在As中表达,能够加速神经退化,这为帕金森病的病理机制研究奠定了一定的基础。