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黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是一类污染农产品、危害人类健康的常见污染物。在免疫分析中,单域重链抗体（VHH）的独特性质引起了人们的注意。与大分子抗原相比,在小分子半抗原（如AFB1）中,比一般抗体互补决定区3（CDR3）长度更长的VHH CDR3的作用仍不清楚。因此,基于VHH CDR3的研究可以探究其与小分子半抗原的亲和力及相互作用,有助于在基因水平上重塑VHH,从而扩展其在食品安全监控领域的应用。在本研究中,从天然的VHH抗体库中筛选出抗AFB1 VHH,并以此VHH为模板,在其CDR3结构域中引入三核苷酸随机化,从而构建半合成的抗AFB1噬菌体展示文库。借助已报道的来自免疫羊驼的抗AFB1 VHH Nb28的帮助构建VHH嵌合体,进一步探索了 CDR3在影响抗AFB1 VHH亲和力中的作用。本研究的主要结果和创新点如下:1.天然抗体库的构建与抗AFB1 VHH的筛选以未经免疫的羊驼血清构建天然的VHH文库:从羊驼外周血淋巴细胞中提取总RNA,反转录为cDNA后利用PCR扩增VHH基因。将VHH基因与噬菌粒载体pComb3X连接并电转化至大肠杆菌ER2738感受态细胞中构建VHH噬菌体展示文库,文库容量为1.5x107cfu/mL。经过四轮竞争-洗脱-生物淘洗后,筛选出抗AFB1 VHH克隆（VHH-2）。在原核表达系统中表达VHH-2,经Ni-NTA亲和柱纯化,SDS-PAGE验证VHH-2的产量约为15.5mg/L,具有良好的溶解性和较高的得率。用phage-ELISA、VHH-ELISA和生物素多肽-ELISA（一种模拟AFB1的多肽）三种方式检测VHH-2对AFB1的结合能力,结果显示AFB1与VHH-2有竞争性结合。经表面等离子体共振（SPR）测定VHH-2与AFB 1的平衡解离常数KD约为6.33x10-5m。第一章的结果表明来自原始VHH文库的VHH-2与-AFB 1具有结合能力。2在CDR3区域引入随机化构建半合成VHH文库采用半胱氨酸保守和无终止密码子的NNK6（C）NNK7模式合成寡核苷酸,在VHH-2框架内的CDR3结构域中引入随机化构建半合成VHH文库,文库容量为1.55x108 cfu/mL,正确插入率＞95%。根据与AFB1竞争结合能力的不同,筛选出3个不同的CDR3的随机VHHs克隆（7M、20M和27M）,经SDS-PAGE和Western blot分析发现3个VHH的表达量远低于VHH-2。将3个VHH与-AFB1进行分子模拟和对接发现在VHH-2中,CDR3上的Thr-106、Tyr-115、Trp-109和Thr-114分别与-AFB1形成两个氢键和两个疏水相互作用;在突变体20M和27M上,CDR3区的Gly-1 13与-AFB1形成疏水作用、Ser 103与-AFB1之间形成氢键;在7M中显示CDR3的结合丧失可能是影响随机化VHH可溶性表达的主要原因。从所有随机VHHs的结果来看,CDR3区域的氢键和疏水相互作用明显促进了 VHHs与AFB1的结合能力。3.构建VHH嵌合体探究CDR3的作用本章利用VHH-2的框架区（FRs）和已报道的高亲和力抗AFB1-VHH-Nb28构建VHH嵌合体,研究CDR3在抗AFB1 VHHs中的作用。两个VHH嵌合体（C3-Nb28和C3-VHH2）是通过将VHH-2的CDR3区与Nb28互换合成的。经SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示使用pComb3X载体表达时,所有的嵌合体都不表达,而在pET-22b中,C3-Nb28从包涵体中提取,C3-VHH2为可溶性蛋白。采用VHH-ELISA法检测两种VHH嵌合体对AFB 1的竞争性结合抑制作用,CDR3区的Cys残基和二硫键缺失可能是CDR3区导致表达缺失的原因。结合分子对接分析,两种VHH嵌合体CDR3区均无结合囊。在C3-VHH2中,结合囊转移至CDR1和CDR2区域,而在C3-Nb28中,FR2和FR3参与了嵌合体与AFB1的疏水相互作用。因此,可以认为CDR3不仅在VHH与AFB1的结合囊形成中起关键作用,而且在可溶性表达和产量方面与VHH的表达框架区具有协同作用。