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目的:血脑屏障(blood brain barrier,BBB)是脑内严格控制物质进出的天然物理屏障,其损伤和功能失调可能导致多种中枢神经系统病变的发生,但是血脑屏障坚固的膜性结构使得药物难以到达其靶点进行治疗。脑微血管内皮细胞是血脑屏障的主要组成成分,内皮细胞间的紧密连接蛋白(包括Occludin、ZO1等)与黏附连接蛋白形成的致密膜间结合是控制血脑屏障低通透性的关键。此外,大脑组织间正常的渗透压梯度也是维持血脑屏障完整性的重要因素。因此,本研究拟构建人脑微血管内皮细胞(HBMEC)损伤模型和SD大鼠血脑屏障损伤模型来分析Occludin/ZO1张力在BBB损伤中的力学调控作用,识别胞内渗透压调控膜流动性以及血脑屏障非选择性通透性的物理机制,为药物在脑病治疗的转运提供新的研究思路。方法:我们采用荧光共振能量转移(FRET)原理和分子克隆技术构建Occludin/ZO1荧光张力检测探针,并转染到人脑微血管内皮细胞(HBMEC)中,将胞内力学变化转换为可见的光学信号,来检测在多种BBB损伤因子刺激下胞内张力变化。具体有(1)应用人血管内皮生长因子(VEGF)、谷氨酸(Glutamate)、过氧化氢(hydrogenperoxide)、组胺(histamine)处理HBMEC,建立人脑微血管内皮细胞损伤模型;(2)采用激光共聚焦技术分析张力探针的有效性和运动性,检测Occludin/ZO1张力在HBMEC损伤模型中的变化及其相互力学作用;(3)通过测量TEER值分析HBMEC损伤模型中细胞的通透性变化;(4)通过检测细胞质渗透压、细胞质蛋白纳米颗粒大小及分布情况来分析细胞内渗透势能变化;(5)通过受体漂白后恢复实验(FRAP)来检测HBMEC细胞中Occludin蛋白在不同药物处理和不同渗透压下的膜流动性变化;(6)建立SD大鼠血脑屏障损伤模型,通过测定脑组织中伊文思蓝含量来研究不同药物处理下BBB非选择性通透性的变化;(7)筛选相关中药单体进行钙离子、氯离子成像实验,进一步阐明影响BBB非选择性通透性的机制。结果:1.验证了所构建荧光张力探针的有效性,这些探针可用来检测HBMEC损伤模型中胞内张力变化;其中VEGF、Glu处理能增强胞内Occludin/ZO1张力,HP、His处理降低了胞内Occludin/ZO1张力。2.在HBMEC损伤模型中,BBB损伤因子处理可以增加细胞质中离子含量,并能激活微丝和微管解聚因子诱导胞内蛋白纳米颗粒的生成及相关渗透压的增加。3.细胞骨架解聚剂处理HBMEC增加了胞内Occludin/ZO1的张力,上调了 Occludin蛋白的膜流动性以及HBMEC的细胞膜通透性。4.给予微丝和微管稳定剂能诱导胞内张力的恢复,拮抗BBB损伤因子诱导的离子水平和渗透压增加,恢复内皮细胞的通透性。5.在SD大鼠BBB损伤模型中,给予微丝微管稳定剂处理可能阻断体内BBB模型的非选择性通透性。6.使用冰片、麝香酮、细辛醚等中药单体处理HBMEC细胞,不仅可以诱导胞内蛋白纳米颗粒相关渗透压的上调,也能增加胞内钙离子和氯离子含量。结论:细胞外BBB损伤因子刺激能导致胞内Occludin/ZO1张力发生改变,诱导MF或MT解聚以及蛋白纳米颗粒的大量生成,继而刺激基于Donnan效应的胞内渗透势能增强,从而引起膜流动性的上调和非选择性药物通透性的增加。本研究揭示了细胞内张力调控血脑屏障功能失调及其通透性增强的重要物理机制,并为改善靶向药物越过血脑屏障到达中枢神经靶位提供了新的研究思路。