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卵母细胞超低温冷冻保存作为重要的生殖辅助技术,在社会多个领域具有非常重要的应用价值。然而,超低温冷冻可引起卵母细胞质量下降,进而导致其胚胎发育潜能下降,甚至胎儿发育异常。因此,改善冻融卵母细胞的发育潜力非常迫切。褪黑素可促进小鼠冻融卵母细胞的体外发育,但其主要作用于卵母细胞后期发育过程中的哪个阶段仍不清楚。因此,本试验旨在研究褪黑素（melatonin,MT）对冻融小鼠成熟（metaphaseⅡ,MⅡ）卵母细胞孤雌发育合子周期进程的影响,确定卵母细胞后期发育效果最佳时MT的作用时间段及其潜在机制。首先,新鲜MⅡ期卵母细胞随机分为三组:对照组、冷冻组、冷冻+MT(10-9mol/L)组。然后,检测褪黑素全程添加与阶段性添加后冻融卵母细胞卵裂率和囊胚发育率。最后,分析卵母细胞孤雌激活后原核形成、S期转变以及与此相关的纺锤体的恢复、染色体的分离、线粒体功能和ROS水平。结果如下:1)褪黑素提升冻融卵母细胞发育潜力冷冻组小鼠MⅡ期卵母细胞的孤雌囊胚率显著低于对照组（33.61±2.92%vs66.67±0.59%,P＜0.05）;试验全程添加MT后,卵母细胞的孤雌囊胚发育率显著升高（57.14±7.47%vs.33.61±2.92%,P＜0.05）。相似的,当冷冻+MT组卵母细胞孤雌发育至2-细胞胚胎时,转移至无MT培养液中,卵母细胞的囊胚率同样显著升高（53.02±3.15%vs.76.47±0.60%,P＜0.05）。说明MT确实可以提升冻融卵母细胞发育潜力,并且其主要作用阶段可能在2-细胞胚胎之前的阶段（合子阶段）。2)褪黑素可调节合子细胞周期进程与对照组相比,冷冻组50%孤雌合子发生第一次卵裂所需时间显著增加（15.47±0.14 vs.14.76±0.22,P＜0.05）;添加MT后所需时间显著低于冷冻组（14.77±0.18 vs.15.47±0.14,P＜0.05）。并且,在卵母细胞孤雌激活6 h和7 h后,冷冻组合子G1/S转变比例显著低于对照组（14.56±3.81%和53.11±3.30%vs.43.71±2.18%和78.92±7.89%,P＜0.05）;添加MT后,合子G1/S转变比例显著高于冷冻组（24.31±3.34%和80.63±8.28%vs.14.56±3.81%和53.11±3.30%,P＜0.05）。此外,卵母细胞孤雌激活11h后,冷冻组合子停留在S期的比例显著高于对照组（10.58±4.19%vs.49.46±5.89%,P＜0.05）,添加MT后,合子停留在S期的比例显著低于冷冻组（49.46±5.89%vs.20.34±1.61%,P＜0.05）。说明MT可以缓解冷冻造成的S期进程的延迟现象。进一步研究发现,合子处于G1末期时（孤雌激活5h）,冷冻组合子线粒体膜电位水平（1.67±0.02 vs.2.26±0.08,P＜0.05）、膜电位相关的ATP水平（0.448±0.015 vs.0.536±0.021,P＜0.05）显著下降。添加MT后,合子线粒体膜电位水平和ATP水平显著升高（1.67±0.02和0.448±0.015 vs.2.10±0.06和0.495±0.007,P＜0.05）。相似的,在S期阶段（孤雌激活9h）,冷冻组合子内ROS水平显著升高（0.01128±0.00032 vs.0.0149±0.00128,P＜0.05）,添加MT后,合子内ROS水平显著下降（0.0149±0.00128 vs.0.00895±0.00034,P＜0.05）。这些结果表明,褪黑素可能通过调控线粒体功能与ROS水平,改善冻融卵母细胞发育合子的细胞周期进程。3)褪黑素促进冻融卵母细胞孤雌激活后原核的形成卵母细胞孤雌激活3-6 h,冷冻组合子原核形成率显著低于对照组（13.39-97.54%vs.4.14-75.74%,P＜0.05）,添加MT后,合子原核形成率显著高于冷冻组（4.14-75.74%vs.14.60-94.07%,P＜0.05）。并且,冷冻组50%合子形成原核所需的时间显著高于冷冻组（3.99±0.056 vs.4.89±0.17,P＜0.05）,添加MT后能显著减少原核时所需的时间（4.89±0.17 vs.4.09±0.033,P＜0.05）。分析减数分裂进程发现,冷冻组卵母细胞复苏培养1h后,纺锤体与染色体的形态等级显著降低（3.24±0.09 vs.2.67±0.11,P＜0.05）。卵母细胞孤雌激活1h后,冷冻组卵母细胞染色体分离率显著降低（83.33±6.25%和vs.43.63±5.27%,P＜0.05）;卵母细胞孤雌激活2h后,其结果与孤雌激活1h情况相似。在添加褪黑素后,纺锤体与染色体的形态等级显著上升（2.67±0.11 vs.3.17±0.11,P＜0.05）。卵母细胞染色体分离率显著上升（43.63±5.27%vs.62.63±3.79%,P＜0.05）,并在孤雌激活2h恢复至对照组水平（77.93±4.03%vs.85.70±4.81%,P＞0.05）。说明冷冻组的纺锤体恢复与染色体分离状况可能会影响后期原核形成,导致细胞周期异常,而褪黑素的添加可以缓解这一现象。综上,MT可通过促进纺锤体形态恢复与染色体分离、原核形成和合子第一次卵裂、改善线粒体功能和降低ROS水平,进而提升合子质量,促进后期胚胎发育。并且针对冻融家畜卵母细胞发育潜力低下的现状,本试验结论可为褪黑素提升冻融卵母细胞发育潜力和体外胚胎的生产提供依据。