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研究背景感染性角膜炎是常见的致盲性眼科疾病,若治疗不及时,很可能发展为角膜溃疡、穿孔,甚至导致失明,给患者的工作和生活造成很多不良影响。白色念珠菌和铜绿假单胞杆菌分别为真菌性和细菌性角膜的主要病原菌,其目前治疗方案主要为抗菌治疗,但由于抗菌菌株的出现及药物渗透性差,很多患者治疗效果不甚理想,因此早期及时的干预和治疗显得犹为重要。中性粒细胞（polymorphonuclear cell,PMN）作为人体固有免疫的重要组成部分,当机体遇到损伤或感染时最先募集到相关部位,进行杀菌或分泌细胞因子对免疫细胞产生趋化效应。中性粒细胞除了可以通过吞噬,产生活性氧物质及脱颗粒以清除微生物,还可以通过产生中性粒细胞胞外陷阱网（neutrophil extracellular traps,NETs）来网罗病原微生物,同时附着在DNA骨架结构上的蛋白酶也能起到一定的杀菌作用。目前,NETs已被证实可以杀灭白色念珠菌和铜绿假单胞杆菌,但对不同刺激产生NETs的杀菌作用比较的研究较少。本研究主要探究不同刺激产生的NETs是否存在清除病原体的差异以及NETs上组蛋白修饰对清除病原体的影响,以期对感染性角膜炎的治疗提供新的证据和思路。研究目的研究不同条件诱导下形成的NETs杀灭白色念珠菌和铜绿假单胞杆菌效率的差异,进一步明确NETs的弹性蛋白酶（neutrophil elastase,NE）和组蛋白甲基化水平对清除病原体的影响。研究方法采用氢氧化钠、佛波酯（phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA）、脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）、白色念珠菌、铜绿假单胞杆菌刺激原代中性粒细胞及诱导分化后的人早幼粒白血病细胞系HL-60以诱导NETs形成,并分别通过sytox green染色与免疫荧光染色以观察不同刺激产生NETs形态的差异,picogreen DNA检测试剂盒以进行胞外游离DNA定量检测。用Alu I酶提取不同诱导条件下产生的NETs,等量稀释后加入到等量白色念珠菌或铜绿假单胞杆菌菌液中共培养1小时,通过比较共培养体系中剩余菌量（白色念珠菌实验:取等量共培养体系溶液滴至琼脂培养板过夜培养,计算菌落数;铜绿假单胞杆菌:取等量共培养体系溶液加入等量LB液体培养基摇菌过夜,测定溶液OD值）来比较杀菌效率。使用蛋白质印迹法（western blot）明确NETs上NE和组蛋白甲基化水平（H3K27me3）对清除病原体的影响。实验中数据统计分析采用Graph Pad Prism 5.0软件和SPSS 23.0软件。结果1.通过对不同诱导条件产生NETs进行sytox green和免疫荧光染色,观察到PMA刺激形成的NETs可见经典网状结构,释放到中性粒细胞胞外的染色质呈丝状、片状且生成NETs的量最多。氢氧化钠诱导形成的NETs较PMA刺激形成的NETs更稀疏,亦可见丝状连结。LPS刺激形成的NETs更多的呈现为散片状,可见多数膨大的细胞核和即将释放的NETs。菌丝相和酵母相的白色念珠菌刺激形成NETs均以核膨大为主且产生的NETs量较其他刺激少。铜绿假单胞杆菌刺激形成的NETs主要以核膨大为主,仅见少量丝状连接。2.使用western blot蛋白质印迹法检测不同诱导形成的NETs上NE和H3K27me3表达水平,结果显示氢氧化钠诱导产生的NETs上NE的表达水平显著高于中性粒细胞组（P＜0.01）、PMA（P＜0.01）、LPS（P＜0.01）、菌丝相白色念珠菌（P＜0.05）、酵母相白色念珠菌（P＜0.01）和铜绿假单胞杆菌组（P＜0.01）,且其H3K27me3的表达水平高于中性粒细胞组（P＜0.01）和LPS组（P＜0.05）。3.杀菌效率研究:1)通过计算各组白色念珠菌菌落数,可以观察到,除白色念珠菌（酵母相）组的菌落数量与仅加入单纯菌液的对照组相比明显减少（P＜0.01）外,其余各组如氢氧化钠、PMA、LPS和铜绿假单胞杆菌组与对照组相比表现出显著的杀菌作用（P＜0.001）,甚至中性粒细胞自发产生的少量NETs也产生了一定的杀菌作用（P＜0.001）。然而,在不同诱导条件组间的比较中,各组无明显差异,仅观察到LPS诱导产生的NETs与中性粒细胞组相比杀灭白色念珠菌的效率更高（P＜0.01）;2)通过测定各组诱导产生的NETs与铜绿假单胞杆菌共培养体系过夜摇菌后溶液的OD值,结果显示,除铜绿假单胞杆菌组与仅加入单纯菌液的对照组相比无明显差异,其余各组如中性粒细胞组、氢氧化钠、PMA、LPS和白色念珠菌（菌丝相和酵母相）组产生的NETs与对照相比均有显著性杀菌能力（P＜0.001）。此外,除铜绿假单胞杆菌诱导形成NETs比中性粒细胞组杀菌效率低,其他诱导条件组如氢氧化钠、PMA、LPS和白色念珠菌（菌丝相和酵母相）组均表现出比中性粒细胞组更高的杀菌效率（P＜0.05）。其中,氢氧化钠和PMA诱导产生的NETs杀菌能力尤为突出（P＜0.001）。结论1.不同诱导条件下产生的NETs的量及形态结构不同,且其DNA骨架上NE和H3K27me3的表达量也存在一定的差异。2.NETs上NE和H3K27me3的表达水平差异可能影响其杀灭铜绿假单胞杆菌的效率,但可能与杀灭白色念珠菌效率没有明确的相关性。