发展环境友好的燃料乙醇可以一定程度缓解我国能源紧张、环境污染的现状,同时也有利于粮食安全。酿酒酵母是发酵生产燃料乙醇的主要菌种,高浓度乙醇发酵可以提高单位体积内发酵终产物的浓度,有效降低后期产物分离的能耗成本。但在发酵初期高浓度底物及逐渐积累的乙醇所产生的环境胁迫会对细胞产生毒害作用,造成细胞活性降低甚至死亡,最终影响发酵强度。研究酿酒酵母响应乙醇胁迫的分子机制、构建高乙醇耐受性菌株对于燃料乙醇的发酵生产具有重要意义。然而酵母菌的乙醇耐性受多基因调控,通过传统的单基因敲除或过量表达很难达到提高酿酒酵母乙醇耐性的目的。前期研究发现酿酒酵母在乙醇胁迫下细胞形态改变,且改变显著的个体或群体有更高的存活率,而调节细胞形态的关键蛋白为Rho家族小GTP水解酶(Rho GTPase),提示Rho GTPase可能与乙醇耐受性相关联,可以作为潜在的调控靶点。Rho GTPase在不同调控水平、多条细胞信号通路发挥广泛的生物学效应,对细胞的状态有“全局”影响,借鉴全局转录调控(gTME)的思路,本研究通过随机突变来改造核心基因Rho1,考察Rho1的定向进化对酵母细胞乙醇耐受性的影响。首先以pYES2.0载体为骨架构建了磷酸甘油酸激酶(PGK1)启动子调控的Rho1组成型表达载体,然后通过易错PCR建立了Rho1突变基因文库,并转化酿酒酵母S.cerevisiae 288C;从酵母突变文库中筛选到了乙醇耐性提高最为显著的突变株M5:在10%(v/v)乙醇培养72 h时的OD600光密度值为对照株(含空载体)的1.38倍;利用初始浓度为300g/L的葡萄糖发酵时,M5突变株的终点乙醇浓度比对照株提高了21.7 g/L;并且M5突变株对高浓度发酵过程中产生的其他胁迫压力如乙酸、氧化胁迫(过氧化氢)也要优于对照株,而过表达Rho1的酵母转化子,其乙醇耐性等与对照株相比均没有明显改变。通过基因测序发现,M5突变株的Rho1氨基酸序列有三个位点发生了突变。本论文的研究结果表明,Rho1基因的定向进化同时提高了酿酒酵母的乙醇耐受性和发酵速率,为酿酒酵母乙醇耐性的代谢工程改造提供了新靶点、新思路。