登革病毒(Dengue virus，DENV)感染引起的登革热是热带和亚热带国家和地区的重要公共卫生问题。DENV主要通过伊蚊（包括埃及伊蚊和白纹伊蚊）的叮咬进行传播。据WHO统计，全世界有超过36亿人生活在登革热流行区，每年感染DENV的人数超过5千万，其中有近3万人死亡。近年来，我国沿海的台湾、福建、广东、广西和云南等均有登革热的流行，并有向内陆蔓延的趋势。因此，急需研制一种安全、有效的登革疫苗用于预防登革热的发生。　　DENV包括4个血清型(DENV1、DENV2、DENV3、DENV4)，且各血清型病毒之间缺乏交叉保护。因此，理想的登革病毒疫苗应是包含4个血清型病毒主要中和抗原的四价疫苗。登革病毒的包膜蛋白（E蛋白）是其主要的结构蛋白，E蛋白不仅能和宿主细胞表面受体相互结合从而介导病毒的入侵，还能诱导宿主产生中和抗体。E蛋白有3个结构域(DⅠ，DⅡ，DⅢ)，其中DⅢ结构域含有多个血清型特异的中和表位和宿主细胞受体识别位点，能够诱导产生病毒型特异的中和抗体，从而发挥免疫保护作用。因此，登革病毒EDⅢ被广泛认为是研制登革疫苗的最有效的候选抗原之一。但由于重组表达的EDⅢ缺乏较好的免疫效应，阻碍了其后续的疫苗开发。因此，如何提高重组EDⅢ的免疫效果是目前亟待解决的科学问题。　　近年来，有研究发现脂质体Lipo(liposome)和蛋白融合表达后可以有效提升目的蛋白的免疫效应。例如，将Lipo多肽分别与DENV2和DENV4的EDⅢ融合表达后的重组蛋白能有效诱导特异性中和抗体的产生，并能降低产生抗体依赖性增强(ADE)效应的风险，这为登革疫苗的研制提供了一种新的策略。考虑到登革病毒变异性强，即使是同一血清型的各流行株之间也存在抗原变异。而筛选各血清型中具有广泛代表性EDⅢ保守序列将为研制有效的登革四价疫苗提供保障。因此，本研究拟首先通过生物信息学分析获得具有广泛代表性的登革病毒1-4型EDⅢ区的氨基酸序列;然后将Lipo多肽与筛选到的保守的登革病毒1-4型EDⅢ区进行串联融合，从而制备一种能同时针对登革病毒各血清型和绝大多数流行株的登革四价重组疫苗，为登革热的防控奠定基础。　　目的：　　首先，筛选具有广泛代表性的登革病毒1-4型EDⅢ区的氨基酸序列;然后，利用GS linker将筛选到的保守DENV1-4 EDⅢ序列与免疫佐剂Lipo多肽形成融合抗原LipoEDⅢ;基于LipoEDⅢ，分别构建登革病毒四价的重组亚单位疫苗和甲病毒复制子疫苗，并在小鼠体内研究这两种候选疫苗的免疫效应，从而为研制新型的登革病毒四价疫苗奠定理论基础。　　方法：　　1.DENV EDⅢ区的生物信息学分析　　通过对黄病毒数据库FLAVIdB(http://cvc.dfci.harvard.edu/flavi/)收录的1795条DENV1、1487条DENV2、1012条DENV3和407条DENV4 E蛋白分别进行氨基酸序列的比对分析，得到氨基酸保守性在90％以上的DENV1-4型EDⅢ区序列作为候选靶抗原序列。　　2.重组LipoEDⅢ蛋白的表达纯化及鉴定　　将编码Lipo多肽和DENV1-4型EDⅢ区的基因序列通过柔性氨基酸链GSlinker进行连接，并插入到冷休克原核表达载体pColdⅢ的多克隆位点，得到重组质粒pColdⅢ-LipoEDⅢ。将构建的重组质粒转化到E.Coli.DH5α感受态细胞中，通过菌液PCR，双酶切鉴定和测序分析获得阳性克隆。　　将重组质粒pColdⅢ-LipoEDⅢ转化到BL21感受态细胞，通过IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定目的蛋白LipoEDⅢ的表达。　　采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白，透析超滤浓缩获得较高纯度和浓度的重组LipoEDⅢ蛋白用于后续的免疫试验。　　3.重组质粒DREP-LipoEDⅢ的构建　　将LipoEDⅢ基因片段连接到甲病毒复制子载体DREP，将构建的重组载体DREP-LipoEDⅢ转化到E.Coli.DH5α感受态细胞中，通过菌液PCR，双酶切鉴定和测序分析获得重组质粒DREP-LipoEDⅢ。并将重组质粒DREP-LipoEDⅢ转染293细胞检测目的蛋白LipoEDⅢ的表达。　　4.LipoEDⅢ重组蛋白和甲病毒复制子疫苗的免疫试验　　分别将纯化的lipoEDⅢ蛋白和复制子DREP-LipoEDⅢ DNA免疫BABL/c小鼠，在第三次免疫后，采用ELISA法检测LipoEDⅢ重组蛋白和DREP-LipoEDⅢ DNA免疫小鼠后多克隆抗体效价来评估其体液免疫效果。并通过检测LipoEDⅢ重组蛋白刺激小鼠脾淋巴细胞分泌的细胞因子如IFN-γ、IL-4和IL-10等评估其细胞免疫效果。　　结果：　　1.利用生物信息学分析获得了具有广泛代表性的登革病毒1-4型EDⅢ序列，其氨基酸序列的保守性在各血清型中均达到90％以上。　　2.成功构建了融合lipo多肽和DENV1-4 EDⅢ区的原核表达载体pColdⅢ-LipoEDⅢ，经过SDS-PAGE电泳和WB鉴定，融合蛋白LipoEDⅢ表达成功，并通过镍离子亲和层析法获得较高纯度的重组蛋白。　　3.成功构建了基于甲病毒复制子的重组质粒DREP-LipoEDⅢ，并转染293细胞48h后，经过SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定，目的蛋白LipoEDⅢ成功表达。　　4.分别以纯化的LipoEDⅢ蛋白和DREP-LipoEDⅢ为抗原免疫小鼠。经过三次免疫后，利用间接ELISA法检测小鼠血清中抗体滴度，其中LipoEDⅢ蛋白免疫组小鼠的血清中抗体滴度可高达1∶40，000。而DREP-LipoEDⅢ免疫组的血清抗体效价较低为1∶160。　　5.利用纯化的LipoEDⅢ蛋白为抗原刺激免疫鼠脾中的淋巴细胞，通过双抗体夹心ELISA检测其分泌的细胞因子后发现，LipoEDⅢ重组蛋白免疫组细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10分别可达40pg/mL，8pg/mL和186pg/mL。DREP-LipoEDⅢ重组质粒免疫组细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10分别可达66pg/mL，23pg/mL和118pg/mL。　　结论：　　1.本研究在利用生物信息学分析获得了登革病毒1-4型中具有广泛代表性的EDⅢ序列的基础上，通过GS linker将编码免疫佐剂Lipo多肽与登革病毒1-4型包膜蛋白EDⅢ区进行串联融合从而获得LipoEDⅢ基因，并将LipoEDⅢ基因分别克隆至pColdⅢ原核表达载体和甲病毒复制子DREP载体，进而成功制备了LipoEDⅢ蛋白和DREP-LipoEDⅢ质粒，将纯化的LipoEDⅢ蛋白与DREP-LipoEDⅢ质粒分别进行动物免疫试验，证实LipoEDⅢ蛋白能有效诱导高水平特异性抗体的产生，而DREP-LipoEDⅢ则能有效诱导细胞免疫应答，为以后构建新型登革四价疫苗奠定了基础。