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健康养殖是保证家畜健康生长、减少抗生素使用和稳定家畜养殖业经济效益的必经之路。“促进奶业振兴”是国家重大战略需求,而奶牛乳腺炎是制约奶牛健康养殖、阻碍奶业发展的主要家畜疾病之一。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是引起奶牛乳腺炎最主要的病原菌之一,它具有极强的环境适应能力和抗生素耐受性,并且可以侵入宿主细胞内部,极难根除。本试验以奶牛乳腺源金黄色葡萄球菌BA01611为研究对象,利用生物化学与分子生物学结合的方法,构建转录因子sigB敲除株和回补株,探究其对金黄色葡萄球菌耐药性及毒力作用的影响与机制。主要结果如下:(1)成功构建金黄色葡萄球菌sigB敲除载体和原位回补载体:将穿梭质粒p KZ2与目的基因sigB同源臂连接,构建敲除载体(p KZ2-ΔsigB)和回补载体(p KZ2-ΔsigB-comp),将载体化学转入大肠杆菌,进而通过酶切及测序方法完成对载体的确证。(2)成功构建金黄色葡萄球菌sigB敲除株及原位回补株:将sigB敲除载体和原位回补载体分别电转入目标菌BA01611,利用同源重组原理与载体温敏特性,成功筛选到金黄色葡萄球菌sigB敲除株(BA01611-ΔsigB)及回补株(BA01611-ΔsigB::sigB)。(3)转录因子sigB对金黄色葡萄球菌生长、溶血、毒力与耐药性的影响:转录因子sigB对金黄色葡萄球菌BA01611生长能力及溶血能力均无显著影响(P>0.05);sigB敲除后丧失金黄色素产生能力,将sigB基因回补后该菌株金黄色素产生能力可恢复到野生型水平;在固体琼脂平板梯度稀释生长条件下,sigB敲除菌株在含有氯霉素(9.8μg/ml)、环丙沙星(12μg/ml)、头孢唑林(40μg/ml)、苯唑西林(16μg/ml)、盘尼西林(7μg/ml)、替考拉宁(0.25μg/ml)和万古霉素(0.6μg/ml)7种抗生素的培养基中生长能力比野生型减少2-4个梯度,回补菌株生长能力可恢复到野生型水平;在液体培养条件下,sigB敲除菌株在含有头孢唑林(6μg/ml)、苯唑西林(15μg/ml)、替考拉宁(0.8μg/ml)和万古霉素(1μg/ml)4种抗生素培养基中对抗生素的耐受性相比野生型减弱。(4)转录因子sigB影响金黄色葡萄球菌耐药性机制初探:Trition X-100诱导自溶试验结果表明sigB会影响金黄色葡萄球菌BA01611细胞壁翻转,sigB敲除株自溶率显著高于野生菌株和回补菌株(P<0.01);q RT-PCR结果表明sigB基因的敲除会使编码β-内酰胺酶的基因bla Z及fstQ,fstW,fstY,fstZ这四个与细胞分裂相关基因在m RNA水平的表达量显著降低(P<0.05)。综上所述,本研究成功构建sigB基因敲除株和原位回补株,并探究sigB对金黄色葡萄球菌耐药及毒力的影响。尽管敲除sigB并没有导致金黄色葡萄球菌生长和溶血方面表型的显著改变,但sigB敲除后细菌丧失金黄色素产生能力,且对多种抗生素耐受性降低。此外,sigB敲除会使金黄色葡萄球菌Trition X-100诱导的自溶活性显著升高,基因bla Z及fstQ,fstW,fstY,fstZ的表达量显著下降。