柠条锦鸡儿与中间锦鸡儿中4个E3泛素连接酶基因的功能分析

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 6次 | 上传用户:hayyangxiong
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柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)和中间锦鸡儿(Caragana intermediaia)而耐旱、耐寒、耐盐碱,是西北干旱地区的重要固沙灌木,筛选其优良抗逆境基因,可以作为林草基因工程的基因源。E3泛素连接酶在植物生长发育和响应逆境胁迫过程中起关键作用。本研究从柠条锦鸡儿干旱消减抑制杂交文库(SSH)和中间锦鸡儿干旱转录组数据库中,分别找到3条RING型和1条U-box型E3泛素连接酶基因EST序列。并对这些基因进行了功能分析,具体结果如下:1.采用实时荧光定量PCR对RING型E3泛素连接酶基因表达模式分析发现,3个基因在柠条锦鸡儿的各组织器官中都有表达,并且受ABA、NaCl和脱水等胁迫不同程度地诱导。2.将克隆得到的3个柠条锦鸡儿E3泛素连接酶基因,分别命名为CkRNF185、CkRNF5和CkRNF111。序列分析发现3个基因分别编码232、230和380个氨基酸。蛋白结构域分析表明,3个蛋白都含有典型的RING型结构域,但是CkRNF185和CkRNF5结构域属于C3HC4型,而CkRNF111结构域属于C3H2C3型。3.构建原核表达载体,对3个蛋白进行表达纯化,利用体外泛素化实验对蛋白酶活性进行检测,结果发现3个蛋白都具有E3泛素连接酶活性。4.在拟南芥中超表达3个E3泛素连接酶基因,并对转基因拟南芥基因功能进行研究。结果表明,过表达CkRNF185基因降低了拟南芥对渗透胁迫、干旱和盐胁迫的耐受性。过表达CkRNF5基因提高了拟南芥在种子萌发期对盐和渗透胁迫的耐受性。过表达CkRNF111基因促进转基因拟南芥叶片早衰。5.利用label-free蛋白定量方法对过表达CkRNF111基因促进拟南芥叶片早衰因素进行分析。共检测到85个变化倍数大于2倍的显著差异表达蛋白。其中上调蛋白65个,下调蛋白20个。KEGG富集分析结果表明,差异表达蛋白主要参与的代谢途径是淀粉和蔗糖代谢与苯丙氨酸合成信号通路,GO富集分析结果表明,这些蛋白的主要生物学功能包括防御响应、叶片衰老、胁迫响应、刺激响应和大分子代谢等过程。由于差异蛋白主要参与淀粉和蔗糖代谢通路,因此推测可能是糖信号引起叶片早衰。并且差异蛋白中很多病程相关蛋白与防御相关。6.中间锦鸡儿U-box型E3泛素连接酶蛋白与拟南芥PUB22(NP190813.1)蛋白一致性为58%,因此将其命名为CiPUB22。CiPUB22基因受脱水、盐和ABA处理的诱导,过表达CiPUB22基因降低了拟南芥在种子萌发阶段对盐和渗透胁迫的耐受力,并对ABA的敏感性增强。
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