幽门螺旋杆菌通过抑制microRNAs调控胃癌细胞B7-H1表达的研究

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第一部分幽门螺旋杆菌通过抑制microRNAs调控胃癌细胞B7-H1表达目的:分析胃癌患者肿瘤组织中B7-H1表达情况以及幽门螺旋杆菌对胃癌细胞系表面B7-H1表达情况的影响,探讨幽门螺旋杆菌感染在胃癌的发生与发展过程中调控胃癌细胞B7-H1表达的具体机制,为肿瘤治疗提供新的思路。方法:收集胃癌患者肿瘤组织标本,分析其B7-H1在肿瘤细胞上的表达情况,并且分析肿瘤组织B7-H1阳性率与胃癌患者性别、年龄、分化程度、TNM分期以及是否感染幽门螺旋杆菌等因素之间的关系;体外共培养人胃腺癌细胞系AGS和幽门螺旋杆菌,并加入干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ),待AGS细胞与幽门螺旋杆菌共培养24小时后收集细胞,用流式细胞术检测幽门螺旋杆菌感染的AGS细胞以及无幽门螺旋杆菌感染的AGS细胞的B7-H1表达水平,观察幽门螺旋杆菌对AGS细胞系B7-H1表达水平的影响;通过microRNA芯片技术分析B7-H1阳性胃癌细胞和B7-H1阴性胃癌细胞microRNA的表达差异,筛选出候选microRNAs;将筛选出来的microRNAs mimics分别转染AGS细胞,并加入IFN-γ刺激培养转染mimics后的AGS细胞,使用流式细胞术检测AGS细胞在不同mimics转然后B7-H1的表达情况,选择出可能调控B7-H1表达的microRNAs;将筛选出可能调控B7-H1表达的microRNAs转染入AGS细胞,同时使用相应microRNAs的抑制剂,使用流式细胞术检测相应B7-H1表达水平,以确定microRNAs对B7-H1表达的影响;使用qRT-PCR检测幽门螺旋杆菌感染的AGS细胞以及普通AGS细胞中microRNAs的表达水平,分析幽门螺旋杆菌感染对AGS细胞microRNAs表达的影响;构建双荧光报告载体,验证microRNA-152以及microRNA-200b靶向作用于B7-H1的3U1TR;收集幽门螺旋杆菌阳性胃癌患者肿瘤组织标本,通过qPCR检测肿瘤细胞中microRNA-152和microRNA-200b的表达水平,同时使用流式细胞术检测肿瘤细胞B7-H1的表达水平,分析胃癌肿瘤组织中microRNAs水平和B7-H1表达水平之间的关系。结果:我们通过收集胃癌患者肿瘤组织标本,分析其B7-H1在肿瘤细胞上的表达情况,发现:幽门螺旋杆菌阳性胃癌标本中,B7-H1表达为阳性的肿瘤标本占64.5%,而幽门螺旋杆菌阴性胃癌标本中,B7-H1表达为阳性的肿瘤标本仅为45.0%;根据胃癌TNM分期,Ⅰ期患者B7-H1表达阳性的肿瘤标本占37.5%,Ⅱ期患者为47.3%,Ⅲ期患者为56.4%,Ⅳ期患者为73.3%;根据患者肿瘤分化程度,高分化肿瘤患者B7-H1表达阳性的肿瘤标本占55.6%,中低分化肿瘤患者为59.4%;高龄(≥60岁)患者B7-H1表达阳性的肿瘤标本占50.0%,非高龄(<60岁)患者为61.4%。使用用流式细胞术检测幽门螺旋杆菌感染的AGS细胞以及无幽门螺旋杆菌感染的AGS细胞的B7-H1表达水平,发现:幽门螺旋杆菌感染的AGS细胞B7-H1表达水平明显高于普通AGS细胞,IFN-γ也能促进AGS细胞B7-H1表达,而且幽门螺旋杆菌和IFN-γ对AGS细胞的B7-H1表达有叠加效应。通过microRNA芯片筛选,并结合靶向预测,我们发现有五个候选microRNAs可能调控B7-H1表达;转染相应mimics之后发现,microRNA-152和microRNA-200b 能显著下调 B7-H1 的表达;在加入 microRNA-152 mimics 和 microRNA-200b mimics以及相应抑制剂共转染时,这种下调效应可以被逆转消除。通过实时定量PCR检测发现,幽门螺旋杆菌感染的AGS细胞中,microRNA-152和microRNA200b表达明显下降,同时在幽门螺旋杆菌感染和IFN-γ的双重刺激下,microRNA-152和microRNA200b表达下降更加显著。构建双荧光素报告载体,发现microRNA152和microRNA200b可以特异性结合B7-H1mRNA的3’ UTR调控转录。收集幽门螺旋杆菌阳性胃癌患者肿瘤组织标本,通过qPCR检测肿瘤细胞中microRNA-152和microRNA-200b的表达水平,同时使用流式细胞术检测肿瘤细胞B7-H1的表达水平,发现肿瘤细胞中B7-H1的表达水平和microRNAs表达水平呈负相关。结论:幽门螺旋杆菌在胃癌的发生和发展过程中,可以抑制microRNAs的表达,从而下调胃癌细胞B7-H1的表达水平,促进胃癌进展。第二部分启动子高甲基化对胃癌microRNA以及B7-H1表达的影响目的:研究胃癌细胞中microRNA表达下调导致B7-H1表达上调的机制。方法:体外培养胃癌细胞系,利用去甲基化药物5-Aza干预胃癌细胞,并通过流式细胞术检测其对胃癌细胞B7-H1的表达的影响,同时通过qRT-PCR检测去甲基化药物对胃癌细胞中microRNA-152和microRNA-200b的表达量的影响;往AGS细胞内转染两个microRNA的特异性抑制剂,再用5-Aza干预转染后的细胞,使用流式细胞术检测其B7-H1的表达情况;通过荧光素酶报告载体实验验证5-Aza对胃癌细胞中microRNA表达的影响;最后研究胃癌患者肿瘤标本中胃癌细胞microRNA启动子甲基化水平和胃癌细胞B7-H1表达水平以及相应microRNA表达水平之间的关系。结果:胃癌细胞系在去甲基化药物刺激后,B7-H1表达下调,其中以AGS细胞系最为明显;去甲基化药物可以上调胃癌细胞中microRNA-152和microRNA-200b的表达;microRNA抑制剂能够减弱5-Aza对胃癌细胞B7-H1表达的抑制作用;荧光素报告载体实验说明5-Aza通过上调microRNA的表达而促进microRNA和B7-H1信使RNA的3’UTR之间的结合;胃癌患者肿瘤组织中胃癌细胞microRNA启动子甲基化水平和胃癌细胞B7-H1表达水平正相关,而与microRNA表达量成负相关。结论:胃癌组织中microRNA高甲基化导致microRNA表达减少,因此其B7-H1表达上调。
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