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肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC,简称肝癌)是全世界范围内常见的恶性肿瘤之一。尽管HCC在手术治疗、放化疗以及分子靶向治疗等方面取得了很大进展,但由于其高侵袭、高转移及高复发等特性,HCC患者预后差的现状仍未发生根本改变。截止目前肝癌发生发展的确切分子机制尚不完全清楚。因此,探讨HCC侵袭转移的分子机制,并寻找有效的治疗靶点以及早期诊断和预后预测的生物标志物是目前HCC研究的重要方向。近年来的研究发现,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在包括肝癌在内的多种肿瘤中异常表达,在肝癌的发生与发展过程中发挥着促癌基因或抑癌基因的重要作用。在本研究中,我们重点对一个新的、在肝细胞肝癌中表达上调的lncRNA LINC02163进行研究,分析其在肝癌组织及肝癌细胞中的表达和临床意义,研究其生物学功能及可能的作用机制。具体内容如下:第一部分LINC02163的分子特征以及在肝细胞肝癌组织中的表达和临床意义目的:分析LINC02163的分子特征,研究LINC02163在肝细胞肝癌组织中的表达及其与肝癌患者临床病理参数和预后的关联,为进一步细胞功能实验奠定理论基础。方法:通过NCBI基因数据库和UCSC基因浏览器分析LINC02163的基因特性及编码能力,并利用编码潜力评估工具(CPAT)和开放阅读框(ORF)查找器进一步证实;运用qRT-PCR检测肝癌及其配对癌旁组织中LINC02163的表达量,分析LINC02163的表达与肝癌患者临床病理参数的关系;结合TCGA数据库中肝癌患者信息,运用Kaplan-Meier分析LINC02163与肝癌患者预后的关系。结果:1.LINC02163属于基因间lncRNA分子,位于人类染色体5q21.2区域,全长316bp,包含3个外显子。LINC02163的编码蛋白质潜力很低,符合Lnc RNA的分子特征。2.通过q RT-PCR检测60对肝细胞肝癌及其配对癌旁组织LINC02163表达水平的结果分析显示,LINC02163在肝癌组织中的表达水平明显高于配对癌旁组织(P<0.001)。3.LINC02163在肝癌组织中的表达与TNM分期、微血管侵犯(MVI)明显相关(P<0.01)。4.对TCGA数据库信息进行Kaplan-Meier生存分析显示,LINC02163在肝癌组织中的高表达与患者较差的总生存率(OS)显著相关(P<0.05)。结论:LINC02163是一个位于人类染色体5q21.2区域的基因间lnc RNA。LINC02163在肝细胞肝癌组织中的表达显著升高,其高表达与TNM分期、微血管侵犯(MVI)及患者较差预后显著相关。第二部分LINC02163对肝细胞肝癌细胞生物学行为的影响目的:通过体外和体内实验观察LINC02163对肝癌细胞生物学行为的影响。方法:运用q RT-PCR检测五株肝癌细胞系(Hu H-7、HCCLM3、MHCC-97H、SNU-182、SMMC-7721)和人正常肝细胞系(L02)中LINC02163的表达情况。设计构建LINC02163 siRNA干扰序列和pcDNA3.1-LINC02163过表达质粒,并转染肝癌细胞构建LINC02163干扰细胞模型及LINC02163过表达细胞模型。通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)实验,观察LINC02163干扰和过表达对肝癌细胞系增殖的影响。通过Transwell迁移、侵袭实验,观察LINC02163干扰和过表达对肝癌细胞系迁移、侵袭能力的影响。通过构建裸鼠皮下成瘤模型和裸鼠肝脏原位移植癌模型,观察LINC02163在体内对肝癌细胞生长和转移的影响。结果:1.与正常肝细胞系(L02)比较,LINC02163在5株肝癌细胞系中高表达,其中表达量相对较高的为Hu H-7和HCCLM3细胞系,而表达量最低的为SMMC-7721细胞系。2.体外细胞功能实验显示,干扰LINC02163表达可以显著抑制HuH-7和HCCLM3细胞系的增殖、迁移和侵袭。相反,过表达LINC02163后,可以显著促进SMMC-7721细胞系的增殖、迁移和侵袭。3.皮下成瘤实验显示,在裸鼠体内LINC02163可促进肝癌细胞生长。裸鼠肝脏原位移植癌转移实验显示,在裸鼠体内LINC02163可以促进肝癌细胞转移。结论:LINC02163在肝细胞肝癌中发挥“促癌基因”的作用,可以促进肝细胞肝癌的发生和发展。第三部分LINC02163调控肝癌细胞迁移、侵袭分子机制的初步研究目的:探讨LINC02163调控肝癌细胞迁移、侵袭的分子机制。方法:运用RNA荧光原位杂交实验(FISH)和质核分离实验观察LINC02163在肝癌细胞中的亚细胞定位。利用生物信息学软件star Base和TargetScan 7.2预测LINC02163可能作用的miRNA及mi RNA可能结合的下游靶基因。运用qRT-PCR检测LINC02163、miR-338-3p、LAMC1的表达水平的调控关系。运用Western blot检测LAMC1及上皮间质转化(EMT)相关标志物(E-cadherin、Vimentin)的蛋白表达水平变化。结果:1.FISH实验和质核分离实验显示,LINC02163在肝癌细胞中主要分布在细胞质里。2.生物信息学软件star Base和Target Scan 7.2预测LINC02163可能作为竞争性内源性RNA(ce RNA)特异性结合miR-338-3p,LAMC1可能为mi R-338-3p的下游靶基因,LINC02163、mi R-338-3p和LAMC1-3’UTR三者之间存在靶向结合位点。3.Spearman相关分析显示,临床肝癌组织标本中LINC02163和LAMC1 m RNA的表达呈显著正相关。在Hu H-7细胞中干扰LINC02163表达可以抑制LAMC1的表达及上皮间质转化过程。相反的,在SMMC-7721细胞中过表达LINC02163可以促进LAMC1的表达及上皮间质转化过程。4.在HuH-7细胞中干扰LINC02163表达可以增加mi R-338-3p的表达。5.在Hu H-7细胞中过表达miR-338-3p可以抑制LAMC1的表达及上皮间质转化过程。结论:LINC02163可能作为mi R-338-3p的分子海绵,负调控mi R-338-3p的表达,且通过抑制miR-338-3p促进上皮间质转化过程,从而促进肝癌细胞迁移、侵袭;此外,LINC02163还可以通过miR-338-3p调控其下游靶基因LAMC1,促进肝癌侵袭转移。