论文部分内容阅读
目的：探讨烧伤血清诱导下,热休克转录因子1对巨噬细胞RAW264.7 TNF-a、HMGB1、IL-10的转录调控作用及其作用机制。方法：1.克隆小鼠热休克转录因子1cDNA,将其插入载体pcDNA3.1,构建热休克转录因子1真核表达载体pcDNA3.1-HSF1,酶切鉴定及测序比对。2.PCR扩增小鼠高迁移率族蛋白Bl(HMGB1)基因启动子序列,将其插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic,构建HMGB1野生型启动子荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-Y,酶切鉴定及测序比对。重叠延伸PCR突变HMGB1启动子HSE核心序列,将其插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic,构建HMGB1突变型启动子荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-T,酶切鉴定及测序比对。3.热休克转录因子1真核表达载体pcDNA3.1-HSF1转染巨噬细胞RAW264.7,烧伤血清诱导后,半定量RT-PCR检测TNF-α、HMGB1、IL-10 mRNA的表达。4.热休克转录因子1真核表达载体pcDNA3.1-HSF1, TNF-a、HMGB1、IL-10启动子荧光素酶报告基因(突变型+野生型),pRL-SV40共转染RAW264.7细胞,烧伤血清诱导后,检测并比较TNF-a、HMGB1、IL-10野生型启动子荧光素酶报告基因与突变型启动子荧光素酶报告基因的相对萤光素酶活性。结果：1.酶切鉴定及测序比对结果均正确,小鼠热休克转录因子1真核表达载体pcDNA3.1-HSF1构建成功。2.酶切鉴定及测序比对结果均正确,小鼠HMGB1野生型启动子荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-Y和HMGB1突变型启动子荧光素酶报告基因pGL3-HMGB1-T均构建成功。3.烧伤血清诱导下,HSF1可以下调巨噬细胞RAW264.7 TNF-a mRNA和HMGB1mRNA的表达,上调IL-10 mRNA的表达。4.TNF-a、HMGB1、IL-10突变型启动子荧光素酶报告基因的相对荧光素酶值较野生型启动子荧光素酶报告基因明显下降,P<0.01,差异有显著统计学意义。结论：烧伤血清诱导下,热休克转录因子1(HSF1)可能通过与TNF-α、HMGB1、IL-10启动子区HSE的结合下调小鼠巨噬细胞RAW264.7 TNF-α、HMGB1mRNA的表达,上调IL-10 mRNA的表达。