论文部分内容阅读
七鳃鳗是现存的最原始的无颌类脊椎动物,营半寄生生活。成年七鳃鳗可通过其头部的吸盘结构来吸食大型鱼类的血肉,因此又被称为水中“吸血鬼”。多年的研究发现,七鳃鳗的口腔腺分泌液lamphredin在其进食过程中扮演着非常重要的角色。尽管前期研究发现lamphredin中含有多种生物活性调节剂,例如:抗凝血剂、离子通道阻断剂和免疫抑制因子等,但是仍有许多未知的低丰度蛋白尚未被鉴定。同时,这些低丰度蛋白质的生物学功能也未知。此外,前期关于七鳃鳗口腔腺蛋白质特性及功能的研究多来源于生殖洄游期的七鳃鳗。由于该时期七鳃鳗不再进食,因此前期的研究也未能实时动态的反映不同进食阶段七鳃鳗口腔腺内全部蛋白质的表达等情况。 为了深入阐明七鳃鳗口腔腺内蛋白质组分与其进食习性的关系,本研究首次采用分辨率较高的NanoLC-MS/MS质谱仪并结合七鳃鳗Ensembl和NCBI两个数据库对不同进食阶段的中国东北七鳃鳗(Lampetra morii)口腔腺分泌液进行比较蛋白质组学研究。研究发现七鳃鳗的进食习性与其口腔腺分泌液蛋白质的数量和种类密切相关。统计分析结果表明:第一,七鳃鳗进食60 min后其口腔腺内鉴定出的多肽或蛋白数量显著增加,为未进食组的10倍以上;第二,在七鳃鳗进食阶段,其口腔腺内蛋白质的分子质量分布更为广泛,且随着进食时间的延长,更多大分子蛋白和小分子多肽陆续出现;第三,GO分析结果表明七鳃鳗进食后,其口腔腺可分泌多种与生物学过程、分子功能和细胞组成等密切相关的蛋白质以帮助七鳃鳗阻断进食过程中所遇到的多种不利反应;最后,功能预测结果表明七鳃鳗进食后,其口腔腺内能够分泌多种功蛋白来阻断宿主的凝血、伤害感受、氧化应激和免疫反应等。在数亿年的进化过程中,这些功能蛋白质的出现为七鳃鳗独特的营半寄生生活方式奠定了基础。 此外,本研究利用质谱在七鳃鳗进食60 min后的口腔腺分泌液中鉴定出了半胱氨酸蛋白酶抑制剂F。近年来研究结果显示来自蛇毒、蚊虫唾液腺等的半胱氨酸蛋白酶抑制剂在抗菌和抗肿瘤等方面发挥了重要的作用。因此本研究也采用分子克隆的手段从七鳃鳗口腔腺中克隆出了半胱氨酸蛋白酶抑制剂F(Lampetra morii cystatinF,Lm-CSTF),并对其进行了生物信息学分析。由于Lm-CSTF的cDNA序列中含有稀有密码子,因此本研究在不改变其编码氨基酸序列的前提下对Lm-CSTF的cDNA序列进行了优化,并将其连接至pColdⅠ原核表达载体,构建pColdⅠ-Lm-CSTF表达质粒,并将其转化至E.coli Chaperone Competent BL21中。结果表明Lm-CSTF以可溶性蛋白质的形式大量表达,这为今后进一步研究其生物学功能奠定了理论和物质基础。 综上,本研究采用比较蛋白质组学方法对不同进食阶段七鳃鳗口腔腺分泌液的蛋白质组分进行了系统及动态的分析。这不仅有助于我们深入阐明七鳃鳗独特的进食机制,还为今后探索新型的七鳃鳗口腔腺功能蛋白提供了线索。除此之外,本研究还为保护和开发七鳃鳗口腔腺内药用相关的基因资源,研制具有我国自主知识产权的新型药物以及推动我国海洋生物的发展奠定了理论基础。