丝状真菌介导的甾体C11β羟基化是甾体工业生产中重要的转化反应之一。目前工业上用于甾体C11β羟化的工业菌种是蓝色犁头霉。蓝色犁头霉对甾体底物的转化特异性不强,会产生大量的副产物。本课题尝试研究建立了一种甾体羟基化快速筛选方法,以期得到通过诱变育种选育高产氢化可的松的优良菌株,同时建立蓝色犁头霉尿嘧啶筛选标记,为进一步研究蓝色犁头霉甾体生物转化的羟化酶基因功能及菌种改造奠定基础。本课题首先以转化产物与浓硫酸显色反应为基础,通过可见光双波长检测,利用朗伯比尔定律,结合三维数据建模二阶校正,建立了可靠的氢化可的松生物转化率的快速测定方法。验证实验显示,该方法与药典方法测定结果具有很高的一致性,能够满足菌种高通量初筛检测的需求。然后,通过正交实验确定了菌体微型化培养的最优条件,结合HC转化率的快速测定方法,建立了高通量菌种筛选平台;并通过等离子诱变构建突变菌株库。经过高通量筛选平台的初筛和摇瓶复筛,获得了一株有较好遗传稳定性的HC高产菌株,与出发菌株相比,转化率提高了 8%。同时,通过对蓝色犁头霉转录组测序,从预测的尿嘧啶合成关键酶--孔清酸核苷5’-磷酸脱羧酶基因(pyrG基因)中挑选出1个候选基因,利用本实验室已建立的隐球酵母分子生物学操作系统,构建了pyrG-1基因的隐球酵母表达载体,对候选基因进行基因功能验证,最终确定了该基因即为目pyrG基因;接着研究了蓝色犁头霉孢子原生质体制备和再生的条件,构建了pyrG基因的敲除载体,建立了原生质体转化法敲除体系。高通量菌种筛选平台为研发甾体羟基化快速筛选体系奠定了基础。同时建立蓝色犁头霉尿嘧啶筛选标记,对蓝色犁头霉羟化酶基因的结构和功能的深入研究及理性改造提供基础。