研究背景及目的地中海贫血,又称“海洋性贫血”和“珠蛋白合成障碍性贫血”,简称地贫。它是一种隐性基因遗传病,可导致遗传性溶血性贫血,也是全球分布最广、累积人群最多的一种单基因病。地中海贫血患者无法制造充足的血红蛋白,进而无法将充足的氧气输送至全身各个器官及组织。器官及组织由于长期处于供氧不足的状态进而无法正常工作继而严重影响患者的正常生长发育。地中海贫血主要发生在地中海沿岸国家、东南亚、非洲和我国南方地区,保守估计全世界地中海贫血基因携带者近2亿人,其中包括我国南方广西、广东、海南等省份。地中海贫血是我国南方省份发病率最高、影响范围最大的隐性遗传病之一,其中尤以广西、广东最甚,据估计两省地贫人数占全国总人数的2/5以上。地中海贫血主要包括α-地中海贫血和p-地中海贫血,a-地中海贫血和p-地中海贫血其分子基础是分别位于16号染色体短臂末端16p13.3位点上的a珠蛋白基因簇的先天性遗传缺陷及位于11号染色体短臂末端11p15.5位点上的p珠蛋白基因簇的先天性遗传缺陷。α-地中海贫血多数情况因为一条染色体上1个或同时2个α珠蛋白基因缺失引起、少数情况由非缺失型突变引起的(αTα或ααT)。α+-地贫(-α)或α0地贫(--)携带者存在着下一代出现血红蛋白H病(--/-α或--/αTa)或重型的Hb Bart’s水肿综合症胎儿的风险。Hb H基因型与该病临床症状严重程度相关,可以是重度贫血,也可以是轻度贫血。最常见的是α0-地贫复合α+-地贫的缺失型Hb H病,然而非缺失型的Hb H病也占有相当的比例。而我国最常见的三种非缺失型α地中海贫血Constant Springα (acsα) αβQuongSzeα (αβQSα) αWestmeadα(αwsα),在α-地中海贫血发病率最高的广西有45.8-53.3%的Hb H病患者携带上述非缺失型α地贫基因。这类病人比那些缺失了3个α珠蛋白基因所表现出来的临床症状更严重,贫血更严重。β-地中海贫血是由于p珠蛋白基因的突变从而引起β珠蛋白链合成减少(β+)或β珠蛋白链缺失(p0),而红细胞膜与过剩的α链结合继而引起的溶血性贫血。世界范围内对该病都有不同程度的关注,世界所有人群和种族均存在其基因缺陷,地中海贫血在我国长江以南数个省份亦有较高的发病率[1]。p-地中海贫血珠蛋白基因的突变主要由于个别碱基的置换、插入或者缺失,因而具有高度异质性,目前为止全球已发现180多种突变类型,其中20多种突变类型在中国被发现[2,3]。中国β-地中海贫血发病人群中超过90%为发病率较高的CD41-42(-CTTT)、IVS-Ⅱ-654(C＞T)、CD17(AAG>TAG)和-28(A>G)4种β-地中海贫血突变类型。由于缺乏有效治疗手段又存在较高的发病率,地中海贫血现在不仅是一个公共卫生问题,也成为了中国南方一个社会经济问题。应用相应分析技术通过人群筛查及产前诊断阻止重症患儿出生是国内外公认的首选预防措施。目前,临床上检测地中海贫血基因点突变类型最常用的方法是斑点杂交(Dot blot)、反向斑点杂交(RDB)、等位基因特异PCR(ARMS-PCR)、多重等位基因特异PCR(Multi-ARMS-PCR)、基因芯片技术和基因测序。然而斑点杂交(Dot blot)、反向斑点杂交(RDB)要花费大量时间、操作繁琐、稳定性差、自动化程度低等缺点；等位基因特异PCR(ARMS-PCR)、多重等位基因特异PCR(Multi-ARMS-PCR)、基因芯片技术和基因测序具有灵敏度高、高通量等优势,但是由于其配备的大型检测设备过于昂贵,这点限制了其在临床的推广应用。且往往一次只能单做a-地中海贫血基因分型检测或单做β-地中海贫血基因分型检测。以上方法均不能满足临床对于地中海贫血高危人群快速准确的基因筛查运用及其在各个基层医院大范围的推广应用。生物传感器技术是由生物化学、电化学、医学以及电子技术等多学科相互渗透发展起来的一种新型的检测技术。近年来电化学方法在检测DNA杂交方面的优点使得DNA电化学传感器的研究得到广泛关注。电化学传感器进行DNA单碱基识别主要是基于DNA杂交反应中不同信号探针产生的不同电化学信号,其检测的高度特异性基于碱基互补配对的高度选择性。由于杂交后双链DNA碱基对的堆积,电极表面形成有效的电子传递链。然而当碱基对中存在单个碱基错配时,电子传递链会由于碱基堆积作用被破坏而中断,而作起放大作用的杂交指示剂信号被中断,从电化学输出信号的变化可识别单碱基的错配。DNA电化学基因传感器的识别选择性通过DNA杂交的三明治结构获得较大的提高,因而DNA电化学基因传感器的特异性比较高。DNA电化学基因传感器生物芯片是将核酸杂交技术和电化学传感器技术组合成的能简单快速、准确廉价地帮助诊断患者疾病的新方法。该技术将在支持物(电极)上有规律的排列固定了大量的ssDNA探针,构成二维的ssDNA探针阵列,与电化学技术接合使用,可同时对大量的DNA进行检测分析,其操作简单、检测效率高且自动化程度高。而且,根据不同固定探针的排列、不同分析方法的使用,DNA电化学基因传感器生物芯片还有其他应用价值,如基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。本研究采用电化学基因传感器技术研制α-地中海贫血和β-地中海贫血电化学基因分型检测试剂,能够一次性简便、快速地检测中国人群常见的3种非缺失型α-地中海贫血点突变基因位点和12种常见的β-地中海贫血点突变基因位点。这15种点突变基因位点包括：非缺失型α-地中海贫血点突变基因位点：αCS、αQs、αwsp-地中海贫血点突变基因位点：-28(A＞C)、Cap(A＞C)、Int(ATG>AGG)、 CD14-15(+G)、CD17(AAG>TAG)、CD26(GAG>AAG)、CD27-28(+C)、 CD31(-C)、CD41-42(-CTTT)、CD43(G>T)、CD71-72(+A)和IVS-Ⅱ-654(C＞T)。以此为α-地中海贫血和p-地中海贫血(简称α-/β-地贫)的临床辅助诊断提供一种新的方法。方法：(一)地中海贫血电化学基因传感器的构建与优化1.捕获探针与信号探针的设计与合成：从NCBI基因数据库中查找到地中海贫血α珠蛋白基因和β珠蛋白基因序列,针对3种非缺失型α-地中海贫血点突变基因位点和12种常见的β-地中海贫血点突变基因位点分别设计合成DNA捕获探针和信号探针。且信号探针和捕获探针序列为与α珠蛋白基因和p珠蛋白基因序列互补的邻近序列。2. 电化学杂交模板的设计与合成：根据信号探针以及捕获探针序列设计与两条探针完全互补配对的序列,作为验证地中海贫血基因电化学传感器芯片的模板。3.杂交时间测试：使用点制好捕获探针的电化学基因传感器生物芯片,加入信号探针及杂交模板的杂交液,使杂交液覆盖固定有特异性捕获探针的PCB板上,将杂交模板与捕获探针、信号探针的杂交时间设置为15min、 20min、25min、30min、35min、40min、45min和60min。采用电化学检测仪检测不同杂交时间内检出的电化学信号值,通过杂交时间梯度实验选出最佳杂交时间。4.杂交温度测试：选取根据设计的探针Tm值(45。左右)选择40℃-47℃的8个温度作为待测杂交温度,按前面得出的最佳杂交时间进行电化学杂交,后采用电化学检测仪检测不同杂交温度下检出的电化学信号值,通过杂交温度梯度实验选出最佳杂交温度。5.信号探针浓度优化：通过Au-S键的形成,将浓度为6pmol/L S-S-ssDNA捕获探针固定至金电极表面形成SAM。点制好捕获探针的芯片通过清洗及组装工艺组装成电化学基因传感器生物芯片。固定杂交模板浓度,信号探针浓度依次为1.5pmol/L、2.5pmol/L、3.5pmol/L.4.5pmol/L.5.5pmol/L、6.5pmol/L. 7.5pmol/L、8.5pmol/L、9.5pmol/L和10.5pmol/L,采用电化学检测仪检测不同信号探针浓度检出的电化学信号值,通过信号探针浓度梯度实验选出各个信号探针的最佳浓度。(二)地中海贫血电化学基因传感器PCR检测方法的建立1.引物的设计与合成：采用Primer Premier 5.0软件和Oligo 6软件设计可以扩增目的片段的特异性引物HBA-F与HBA.R、HBB.1F与 HBB-1R、HBB-2F与HBB-2R、HBB-3F与HBB-3R。其中HBA-F与HBA-R扩增1个α珠蛋白基因片段,HBB-1F与HBB-1R、HBB-2F与HBB-2R、HBB-3F与HBB-3R分别扩增3个β珠蛋白基因。2.多重不对称PCR扩增体系优化：以野生型人全血基因组为模板,依次从单重对称PCR扩增、单重不对称PCR扩增到多重不对称PCR扩增进行引物用量测试,结合电泳及电化学检测信号值两个结果调整体系中引物用量,确定各对引物在整个多重不对称PCR扩增体系中的最佳用量。(三) 地中海贫血电化学基因传感器基因分型的性能验证提取由三家三级甲等医院收集的901例临床全血样本的基因组DNA,进行金标准测序的同时用前述业已建立的电化学基因传感器检测方法,对这些样本中的15个地中海贫血基因位点进行定性检测,最终检测电化学检测结果与测序结果的一致性进而验证电化学基因传感器检测方法的检测能力及可靠性。结果：(一) 地中海贫血电化学基因传感器的构建与优化捕获探针与信号探针及电化学杂交模板设计成功后由进行上海生工生物(Sangon Biotech)公司合成。45min内,杂交时间的增加电化学信号值呈增高趋势,但30min至45min的4个杂交时间中,信号值升高的幅度大幅下降,基于检测时间和检测信号最佳平衡考虑,我们将杂交时间设为30min. 40℃,41℃和42℃条件下,出现的非特异信号均较高,不利于后期结果的判断,而44℃-47℃条件下,虽然几乎非特异信号,但是本身信号值降低也十分明显,最终确定杂交温度为43℃。捕获探针浓度固定为6pmol/L,固定杂交模板浓度,检测二茂铁信号探针浓度的线性范围。当信号探针的浓度低于3.5pmo1/L时,电化学信号值变化较小；当信号探针浓度大于3.5pmol/L时,电化学信号值开始明显增加；信号探针浓度升到5.5pmol/L时,电化学信号值开始大幅度增高；而当信号探针浓度大于8.5pmol/L时,电极的电化学信号值基本无太大变化,说明地中海贫血电化学基因传感器检测的线性范围在一定程度上受二茂铁信号探针浓度的影响,最终确定各个信号探针浓度为7pmol/L～8.5pmol/L之间。(二) 地中海贫血电化学基因传感器PCR检测方法的建立引物设计成功后由进行上海生工生物(Sangon Biotech)公司合成。确定多重不对称PCR反应体系为50μL,含10× buffer (TAKARA) 5μL、dNTPs(25 mmol/L) 0.4μL、Betaine(5mmol/L) 8μL、Hot start Taq酶(1OU/μL) 0.3μL、浓度为10pmol/L的上游引物HBA-F0.2μL, HBB-1F、HBB-2F、HBB-3F各0.1μL,浓度为10pmol/L的下游引物HBA-R、HBB-1R、HBB-2R, HBB-3R各1μL,DNA模板2μL。确定PCR反应条件为94℃预变性15分钟,然后按94℃ 45秒→58℃30秒→72℃ 45秒扩增,35个循环,最后72℃延伸10分钟。(三) 地中海贫血电化学基因传感器基因分型的性能验证应用901例临床样本验证地中海贫血电化学基因传感器特性,除4例样本由于本身质量问题提取失败外,15种地中海贫血点突变基因位点均能被正确识别。与测序结果有极好的一致性。当靶DNA与相应的捕获探针及不同二茂铁标记的信号探针序列完全互补配对时,电极上相应氧化还原电位的电化学信号急剧上升；当探针与靶DNA互补序列中存在单个碱基错配时,相同信号探针浓度和靶DNA浓度下,存在错配的序列其电化学信号值较完全互补序列小很多,甚至不产生电化学信号。因此,本实验设计的地中海贫血电化学基因传感器能准确地区分相应的基因型别。结论：通过对反应条件的优化,以Thiol-Modifier C6 S-S标记探针为捕获探针,二茂铁标记探针为信号探针,基于碱基互补配对原理,通过夹心法构建的地中海贫血电化学基因传感器基因分型试剂,用于检测地中海贫血点突变基因分型具备现实的可行性。在一定的样本浓度范围内,本实验设计的地中海贫血电化学基因传感器可准确辨别DNA序列中的单碱基突变,因而具有较好的特异性。本实验制备的地中海贫血电化学基因传感器通过后续的研究和改进还可以进一步提高检测的灵敏度和准确性,且生物传感器具有操作简便,价格低廉,更易于在临床上推广应用的优点,有望经进一步优化后应用于生产。Development of an electrochemical DNA sensor for the detection of α-thalassemia and β-thalassemia