奶牛乳腺炎是奶牛产后重要疾病之一,会造成巨大的经济损失。乳腺炎不局限于细菌感染,其特征在于白细胞和血清蛋白从血液转移到感染部位的运动。硒是哺乳动物饮食中的必需营养物质,具有一些抗炎性质。硒以硒蛋白的形式存在于机体中,并主要通过其抗氧化作用参与到机体的免疫防御机制中。多项研究己证实,饲喂添加适量的硒的饲料,可以最大限度地降低动物群体中乳腺炎,白肌病以及呼吸系统方面的疾病的发病率。肽聚糖(PGN)是金黄色葡萄球菌细胞壁结构上的主要成分,有研究表明金葡菌的肽聚糖可以刺激宿主细胞上相关病原识别受体,激活炎症信号通路。因此,本论文从分子学的角度研究了硒的抗炎作用以及硒对相关炎症信号通路的影响,为乳腺炎未来的防控发展提供了理论依据。金黄色葡萄球菌是临床上奶牛乳腺炎最重要的致病菌之一,通过研究其一种致病因子来探索其致病机理以及机体对其反应机制,这对奶牛乳腺炎的防治具有重要的现实意义。我们通过胶原酶完全消化法体外培养了一批奶牛乳腺上皮原代细胞,用PGN侵染细胞构建了奶牛乳腺上皮细胞(bMEC)炎症模型,检测在PGN刺激下其细胞因子表达的变化。实验结果表明,乳腺上皮细胞在汇合之前呈典型的岛屿状集落生长,汇合之后的细胞形态具有典型的铺路石样、导管样结构的特点,一直培养下去会形成穹窿样结构。为了探索硒浓度对奶牛乳腺上皮细胞活性的影响,我们选择不同浓度(0、1、2、4、8、16、32和64 μM)的硒处理奶牛乳腺上皮细胞12 h后,利用MTT法对活细胞特有的反应检测细胞存活率。结果表明,在0～16μM范围内的硒浓度对细胞活性影响不大,16μM以上随着硒浓度的增加,乳腺上皮细胞的存活率逐渐下降,且在32 μ和64 μM的硒浓度时细胞活性与对照组相比出现极显著下降(p<0.001),这说明高浓度的硒对乳腺上皮细胞具有损伤作用。为研究硒在PGN诱导的BMECs的炎症反应中对TLR2和Nod2信号通路的影响。不同浓度的硒(2、4和8μM)添加在培养液中,检测硒对TLR2、Nod2/NF-κB、MAPK信号通路的影响。实验结果表明,PGN刺激后8h,1Oh,12h时,2、4和8μM的硒均能有效地抑制PGN诱导的bMECs TLR2通路上,TLR2,Myd88;Nod2通路上Rip2以及两条通路的下游NF-κB,TNF-α,IL-1β,IL-6促炎因子的基因表达(p<0.01或p<0.001)。其中8h时,2和8 μM的硒对Nod2没有明显的抑制作用。我们采用Western Blot技术从蛋白水平研究硒对炎症信号通路的影响,尤其是对TLR2、Nod2/NF-κB、MAPK信号通路中关键蛋白的表达进行检测。将bMECs分成5组,以不添加亚硒酸钠和PGN的细胞作为空白对照组,以加PGN刺激0.5 h的细胞作为模型组,以添加不同浓度的亚硒酸钠(2、4和8 μM)预孵12 h并用PGN刺激0.5 h的细胞作为加硒剂量组,分别检测 TLR2,Myd88;Nod2、Rip2、Card9;IκBα、p65;p38、JNK 和 Erk 蛋白的磷酸化水平。结果显示,PGN刺激乳腺上皮细胞0.5h后TLR2、Myd88、Nod2、Rip2、Card9、IκBα、p65、p38、JNK和Erk蛋白的磷酸化水平与空白对照组相比极显著上升(p<0.001)。与模型组相比,4μM的硒能极显著抑制PGN诱导的TLR2通路TLR2、Myd88的磷酸化;Nod2通路Rip2的磷酸化;NF-κB通路IκBα、p65的磷酸化(p<0.001),同时极显著降低了 PGN诱导的MAPK通路p38、JNK和Erk的磷酸化(p<0.001)。这些结果表明4μM的硒通过调节TLR2以及Nod2信号通路的中上游关键蛋白的表达进而起到对NF-κB以及MAPK信号通路的抑制作用,最终下调了 PGN诱导bMECs相关炎性细胞因子的释放,减弱了 PGN诱导bMECs的炎性损伤。