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MicroRNAs(简称miRNA)是一类内源的长约20～24碱基的RNA分子，它们通过mRNA降解和翻译抑制等方式，特异地对靶基因进行转录后调控.microRNA393是植物中一个保守的microRNA家族，拟南芥中miR393由2个基因MIR393a和MIR393b编码，其转录物前体经加工后，形成序列完全相同的成熟miRNA分子。研究表明AtmiR393的靶基因是生长素受体TIR1(TRANSPORTINHIBITOR RESPONSE PROTEIN1)和三个F-box家族成员AFB1(AUXINSIGNALINGF BOX PROTEIN1)、AFB2和AFB3。目前对MIR393家族成员的表达调控机制，以及miR393的生物学功能仍然知之甚少。本研究开展了拟南芥MIR393基因家族成员表达模式和转录调控分子机制的研究，并通过对转基因系的表型观察，以期阐明miR393在拟南芥生长发育和生长素应答中的功能。主要结果如下：
1拟南芥MIR393基因家族表达模式研究
1.1Small RNA Northern blot结果显示成熟miR393的积累呈现发育阶段和组织特异性。10天幼苗中，茎干中的miR393水平高于根部，4周苗叶和花序中miR393水平较高。通过miR393前体的半定量RT-PCR检测，发现两个家族成员MIR393a和MIR393b在植株生长发育中的表达模式并非完全相同。同时，pMIR393a:GUS和MIR393b7b：US报告株系的GUS组织化学染色结果表明两者表达位置基本相同，主要在主根、下胚轴、叶片、花序和荚果的维管组织中表达，而在侧根原基和根尖中未检测到表达，但MIR393b启动子活性高于MIR393a。
1.2利用半定量RT-PCR检测靶基因的组织特异性表达水平，结果表明miR393的表达与靶基因的转录本水平未呈现明显的负相关性。同时，利用启动子报告株系观察MIR393与靶基因转录的组织特异性，GUS染色结果显示MIR393和靶基因的转录有协同表达和相斥表达两种形式。在叶脉、茎尖分生组织、下胚轴、根的中柱等区域，MIR393和靶基因两者呈现协同表达，有一定的重叠性，且MIR393转录区域的分布比靶基因更集中；而在侧根原基和根尖中，靶基因表达强烈，MIR393却不表达，两者的转录表现出明显的相斥性。
2外源激素和非生物胁迫下拟南芥MIR393基因家族的转录调控研究
2.1 Northern blot检测结果显示外源高浓度生长素(IAA)处理能诱导miR393的积累，前体定量PCR结果表明MIR393b而非MIR393a受到了IAA诱导，说明MIR393b转录的增强是引起miR393积累的因素之一。pTIR1/AFBs:GUS报告株系在受到IAA处理后GUS基因的表达有所增强，而实时定量PCR检测显示靶基因转录本水平均无显著变化。因此推测在外源IAA处理下miR393的积累是在转录后水平调控靶基因的稳态。
2.2定量RT-PCR结果表明脱落酸(ABA)和甘露醇能诱导MIR393a的表达，而2，4-D和冷处理诱导MIR393b的表达，说明ABA和一些非生物胁迫处理能特异性诱导MIR393基因家族成员转录水平的增强。
3拟南芥miR393在生长素信号通路和生长发育中的功能研究
3.1通过构建35S:MIR393a和35S:MIR393b表达载体，获得了miR393过量表达的拟南芥转基因纯系，RT-PCR检测结果显示靶基因TIR1、AFB2和AFB3的转录本水平明显下降，而AFB1无显著变化。此外，定点突变了TIR1基因的miR393特异结合位点，克隆了抗miR393降解的TIR1(mTIR1)。构建了35S:mTIR1和35S:TIR1两种靶基因过量表达载体，获得了转基因纯系。Northern blot结果显示35S:mTIR1株系中TIR1 mRNA水平显著高于35S: TIR1。这些结果进一步证实了miR393对TIR1、AFB2和AFB3转录后的抑制作用。
3.2通过表型观察，发现过量表达miR393导致主根和下胚轴伸长，侧根数量明显减少，这些现象与已报道的tirl-1突变体的表型相吻合。而过量表达TIR1基因则导致侧根数增加，其中过量表达mTIR1导致主根长度的显著缩短、侧根数的急剧增加，说明了miR393介导的TIR1水平调控对根的发育，特别是侧根的发生起到重要的调节作用。
3.3通过检测拟南芥幼苗在外源IAA处理条件下的主根伸长量，观察miR393对植株生长素敏感性的影响。结果表明过量表达miR393的植株对外源生长素的敏感性降低，而35S:TIR1植株对外源生长素的敏感性有所增强，35S:mTIR1生长素敏感性显著增强。同时，用定量PCR的方法检测了三个生长素应答基因DFLl/GH3.6(AtSg54510)、AXRS/LAAJ(At4g14560)和MSG2/IAA19(At3g15440)的表达情况，结果表明miR393介导的TIR1调控，不仅改变了在非处理条件下这些基因的表达水平，同时改变了它们对IAA处理的应答，从而对拟南芥生长素敏感性产生影响。
3.435S:mTIR1转基因株系表现出生长素相关表型的多效性，如不定根数量增加，叶片边缘下卷，叶柄上卷伸长，叶片数量减少，顶端优势明显，只有主茎而无侧枝，植株生长发育延缓等，说明miR393介导的对TIR1的调控是通过植物生长素信号通路在拟南芥生长和发育中起重要功能的。
3.5利用Northern blot检测了野生型、35S:TIRI、35S:mTIR1和tirl-1、tir/afb四突变体中miR393的水平。与野生型相比，35S:mTIR1转基因系中miR393的水平约上调了1.5倍，35S:TIRI转基因系中没有显著变化，而在tirl-1、tir/afb四突变体中miR393的表达量降低了约40％。结果说明miR393受到靶基因TIR1的正反馈调控。
根据上述结果，本研究提出了一个通过miR393/TIR1调控生长素信号的模型。生长素通过增强AtMIR393b的转录，引起miR393水平的提高；一些非生物胁迫通过特异性提高不同MIR393成员的转录水平，导致miR393的积累；miR393在转录后水平抑制TIRI/AFBs的表达，从而负调控植物生长素反应；同时，高水平TIRI的表达也能通过反馈调控的方式促进miR393的积累。MIR393表达的特异性调控及miR393-靶基因的相互作用提供了一种基因表达的精细调控模式，这种调控模式对于植物发育过程的生长素反应和非生物胁迫应答反应具有重要意义。