背景作为第二大哺乳动物群,蝙蝠品种众多,为微生物的繁殖提供了一个巨大的温床。蝙蝠为唯一的飞行哺乳动物,呈世界性分布,栖息地多样化,群居。蝙蝠的飞行能力使得蝙蝠可将微生物携带到广泛的区域。蝙蝠的世界性分布和栖息地多样化使得人群广泛暴露于蝙蝠源微生物。蝙蝠为群居动物,近距离的接触促进微生物在蝙蝠之间的传播,使得微生物在蝙蝠中能够稳定地循环下去。蝙蝠作为一种古老物种,寿命长。漫长的进化过程中为微生物与蝙蝠共进化提供了充足的时间,使得蝙蝠成为这些微生物的自然宿主。蝙蝠的长寿命有助于微生物的传播。在冬天蝙蝠冬眠以节省能量,体温和代谢率降低可能会抑制免疫反应,从而延缓微生物从蝙蝠体内的清除。蝙蝠经常被认为是各种新发病毒的宿主,其中一些新发病毒,如SARS-Co V、MERS-Co V、亨尼帕病毒、埃博拉病毒和马尔堡病毒对人高度致病。自2003年SARS暴发后,对蝙蝠携带病毒的研究急剧增加,从蝙蝠中分离或检测到大量的新型病毒。由于蝙蝠感染病毒后无明显的临床症状,蝙蝠被认为是这些病毒的自然宿主。到目前为止,蝙蝠在人兽共患传染病中发挥的作用尚未得到充分的理解,尤其对蝙蝠携带的细菌和寄生虫的研究很少。目的为了更好地评估蝙蝠对人类健康构成的潜在危害,本研究对山东省蒙阴地区蝙蝠携带的病毒、细菌和寄生虫进行分子生物学调查。方法本研究从山东省蒙阴县采集食虫蝙蝠145只,基于细胞色素B(cyt B)基因,采集的蝙蝠属于2个蝙蝠科的6种蝙蝠:马铁菊头蝠(Rhinolophus ferrumequinum)和菲菊头蝠(Rhinolophus pusillus)属于菊头蝠科(Rhinolophidae);大棕蝠(Eptesicus serotinus)、毛腿鼠耳蝠(Myotis fimbriatus)、大足鼠耳蝠(Myotis ricketti)和北京鼠耳蝠(Myotis pequinius)属于蝙蝠科(Vespertilionidae)。提取蝙蝠组织和血液样本的DNA/RNA,通过PCR对蝙蝠携带的病毒、细菌和寄生虫进行筛查。1.采用兼并引物对蝙蝠的肠道/肺标本进行冠状病毒(Coronaviruses)、星状病毒(Astroviruses)、汉坦病毒(Hantaviruses)、副黏病毒(Paramyxoviruses)、腺病毒(Adenoviruses)和圆环病毒(Circoviruses)调查。2.首先从蝙蝠的血液标本中扩增巴尔通体(Bartonella)RNA聚合酶B(rpoB)基因进行初筛,对rpo B阳性样本进一步扩增柠檬酸合酶(glt A)基因对巴尔通体进行基因分型。3.从蝙蝠的脾脏标本中扩增疏螺旋体(Borrelia)的16S rRNA(rrs2)、甘油磷酸二酯磷酸二酯酶(glp Q)和鞭毛蛋白(fla B)基因,这三个基因通常用于回归热疏螺旋体的分型鉴定。4.采用巢式PCR从蝙蝠肾脏样本中扩增rrs2基因进行钩端螺旋体(Leptospira)检测。对蒙阴地区蝙蝠中检测到的钩端螺旋体通过多位点序列分型(MLST)扩增7个管家基因(glm U、pnt A、suc A、tpi A、pfk B、mre A和cai B)进行序列分型(STs)。5.通过实时荧光PCR从蝙蝠的血液标本扩增glt A和RC0338基因进行立克次体(Rickettsia)筛查。6.从蝙蝠的血液标本中扩增18S r RNA和线粒体细胞色素C氧化酶亚单位Ⅰ(cox1)基因对巴贝西虫(Babesia)进行筛查。7.扩增甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gGAPDH)和18S rRNA基因以确定蒙阴地区蝙蝠携带锥虫(Trypanosoma)的多样性。结果1.本研究发现蒙阴地区蝙蝠携带冠状病毒、星状病毒、腺病毒和圆环病毒,阳性率分别为21.4%(31/145)、15.9%(23/145)、20%(29/145)和35.2%(51/145)。蝙蝠科的四种蝙蝠均携带冠状病毒、星状病毒、腺病毒和圆环病毒;菊头蝠科的两种蝙蝠均携带圆环病毒,其中一个种携带冠状病毒,而星状病毒和腺病毒为阴性。本研究未检测到汉坦病毒和副黏病毒。星状病毒、腺病毒和圆环病毒在毛腿鼠耳蝠中的携带率最高,冠状病毒在大棕蝠中的携带率最高。BLAST分析表明本研究检测到的大部分病毒序列与目前已知病毒序列的核苷酸和氨基酸相似性低,因此可能代表新的病毒种。基于DNA多聚酶(pol)基因,本研究从蒙阴地区的蝙蝠中检测到了α-Co V和β-Co V。值得注意的是,本研究中检测到的C支系β-Co V,与MERS-Co V的核苷酸相似性为85%-88%。基于星状病毒RNA依赖的RNA聚合酶(Rd Rp)部分基因序列的进化分析表明本研究检测到的大部分星状病毒与先前研究检测到的蝙蝠星状病毒形成一个单独的蝙蝠星状病毒枝。但是,本研究也发现几株蝙蝠星状病毒与猪/小鼠/大鼠星状病毒相近。根据pol基因的部分序列,本研究检测到的腺病毒属于哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)。进化分析表明本研究检测到的腺病毒表现出宿主特异性,并且存在跨物种传播的可能。基于圆环病毒复制相关蛋白(Rep)基因序列的进化分析表明本研究检测到的圆环病毒无明显的宿主特异性,可分为10个基因型,其中9个基因型属于圆环病毒属(Circovirus),另1个基因型属于环转病毒属(Cyclovirus)。2.通过PCR扩增glt A基因,本研究从25.2%(27/107)的蝙蝠中检测到了巴尔通体,阳性蝙蝠包括马铁菊头蝠(1/3)、菲菊头蝠(2/10)、毛腿鼠耳蝠(9/16)、大足鼠耳蝠(1/5)和北京鼠耳蝠(14/58)。进化分析表明蒙阴地区蝙蝠中检测到的巴尔通体可以划分为至少10个基因型,其中一些基因型代表新种。本研究还发现蝙蝠携带的巴尔通体和蝙蝠种之间存在相关性,单只蝙蝠可感染不同巴尔通体种。3.根据rrs2、glpQ和flaB基因,本研究从一只大足鼠耳蝠中检测到了一种新型疏螺旋体(命名为Bat Borrelia sp.SD065),该疏螺旋体与一组包括Borrelia turicatae、B.parkeri和Candidatus B.johnsonii在内的新世界回归热疏螺旋体相近。4.通过PCR扩增rrs2基因,本研究发现蒙阴地区蝙蝠的钩端螺旋体的携带率为50%(62/124),并且钩端螺旋体阳性的蝙蝠均为鼠耳蝠(毛腿鼠耳蝠、大足鼠耳蝠和北京鼠耳蝠)。从蒙阴地区蝙蝠中检测到的钩端螺旋体均属于致病性钩端螺旋体,包括Leptpospira borgpetersenii、L.kirschneri以及大量潜在的新种。多位点序列分析确定了3种新的L.kirschneri ST型。此外,本研究还发现该地区蝙蝠普遍存在共感染不同钩端螺旋体现象。5.本研究未检测到立克次体。6.基于巴贝西虫的18S rRNA和cox1基因,本研究从2只大棕蝠中检测到了对蝙蝠致病的Babesia vesperuginis。7.从10.3%(13/126)的蝙蝠中检测到锥虫属DNA,经鉴定均为Trypanosoma dionisii。阳性蝙蝠包括大棕蝠和北京鼠耳蝠。结论1.本研究首次从中国的毛腿鼠耳蝠和大棕蝠中检测到C支系β-Co V。本研究也是首次从毛腿鼠耳蝠和北京鼠耳蝠中检测到冠状病毒,从大棕蝠、毛腿鼠耳蝠和北京鼠耳蝠中检测到腺病毒,增加了我们对蝙蝠携带冠状病毒和腺病毒多样性的了解。2.本研究首次从中国的蝙蝠中检测到巴尔通体,扩大了我们对蝙蝠携带巴尔通体遗传多样性的了解,同时也揭示了蝙蝠携带巴尔通体的生态学特征。3.从蒙阴地区蝙蝠中检测到Bat Borrelia sp.SD065代表首次在旧世界发现Borrelia turicatae样回归热疏螺旋体,扩大了我们对新世界回归热疏螺旋体地理分布的认知。4.本研究发现蒙阴地区的鼠耳蝠中致病性钩端螺旋体携带率高、遗传多样性广,表明在该地区鼠耳蝠是钩端螺旋体的重要携带者。5.本研究首次从中国的大棕蝠中检测到Babesia vesperuginis,表明Babesia vesperuginis有广泛的宿主范围和地理分布。6.本研究首次对中国地区蝙蝠携带的锥虫进行检测,为亚洲地区蝙蝠携带锥虫的遗传多样性提供了宝贵的信息。本研究从蒙阴地区蝙蝠中检测到了多种潜在的新型病毒、细菌和寄生虫,尽管对这些微生物的致病性尚不清楚,但是有必要对蝙蝠源病原微生物进行监测,防止跨物种传播的发生。