干细胞(stem cells)是一类具有自我更新和多分化潜能的细胞。根据其来源可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES cells)和成体干细胞(adult stem cells)。胚胎干细胞是由早期囊胚的内细胞团或原始生殖细胞中分离获得的具有多潜能性特征的细胞。胚胎干细胞在适合的条件下能够分化为机体的内、中、外三个胚层来源的所有组织细胞,其研究不仅在认识细胞分化、胚胎发育机理具有重要作用,而且对基因功能研究、转基因动物制备、克隆动物、建立动物和人类疾病模型、药物的开发与筛选、肿瘤发生发展机制和治疗方法探讨、细胞组织和器官的修复和移植治疗等方面研究有着极其重要的价值。人胚胎干细胞系(human embryonic stem cell lines, hES cells)最早于1998年由Thomoson JA等人成功建立,该成果被评为“1999年世界十大科技进展之首”,此后十余年来,干细胞领域出现了很多令人振奋的研究成果,由此掀起了世界范围的干细胞研究热潮。至今,胚胎干细胞及各种成体干细胞的研究是目前生物学和医学领域的热点和前沿。人类胚胎干细胞具备有自我更新及多潜能性这两个最重要的特征。研究人胚胎干细胞自我更新和分化机制是干细胞生物学的热点和重点,也是其用于细胞替代和组织工程的基础,同时,近年来研究发现,研究胚胎干细胞自我更新机制可能为探讨细胞重编程(reprograming)机制,为建立自体细胞诱导多潜能性细胞(Induced pluripotent cells, iPS cells)从而为个体化再生医疗奠定基础。目前发现,胚胎干细胞自我更新的维持可能与多种信号通路、核心转录因子、细胞周期调控因子、DNA甲基化及染色体稳定性等有关。在这些机制中,关于一些核心转录因子(Oct4、Nanog、Sox2等)及信号通路(WNT信号通路、FGF/PI3K信号通路、TGFβ信号通路等)的研究一直是人们关注的热点并且已经达到相当的深度。尽管如此,目前关于胚胎干细胞自我更新及多潜能性特征的机制仍远未清楚,对其进行进一步深入探讨仍具有重要意义。在神经科学领域神经损伤的修复以及以帕金森氏病(Parkinson’s disease)、亨廷顿氏病(Huntington’s disease)以及阿尔滋海默氏综合症(Alzheimer’s disease)为代表的神经退行性疾病的治疗目前仍然是医学界的难题。近年来,以神经干细胞(Neural stem cells)等为代表的干细胞领域的研究突破打破了传统认为的神经组织不可再生的观点,同时,尽管目前尚有不少难题需要解决,但干细胞移植已被认为可能是从根本上治疗神经系统难治性疾病的最有希望的方法之一。由胚胎干细胞和与胚胎干细胞类似的多潜能性iPS细胞体外分化可以获得各种神经组织细胞(包括神经干细胞、神经元、神经胶质细胞等)。因而,胚胎干细胞的体外分化不仅为研究胚胎早期发育和细胞分化的分子机制提供了良好的细胞模型,也可为未来的临床上的移植治疗提供充足的供体细胞来源。因此,研究人类胚胎干细胞的神经分化机制具有不同寻常的意义。前期研究中,通过芯片筛选、电子克隆、RACE等方法,本研究组(由中南大学肿瘤研究所分子病理室及中南大学湘雅医院神经外科部分人员共同组成)在世界上首次成功克隆并命名了一个人类新基因HESRG (human embryonic stem cell-related gene),已提交国际基因序列数据库GenBank收录,其序列号为DQ445779。该基因位于人染色体3p14.3。在成功克隆HESRG基因全长的基础上,本研究组前期研究中发现：1、将HESRG基因与NCBI收录的核酸进行序列比对,结果发现该基因仅与黑猩猩(Pan troglodytes)、恒河猴(Macaca mulatta)等灵长类动物部分序列同源,在非灵长类的其它各种生物未见同源序列；2、通过融合基因表达策略、Western blot和免疫组化检测等手段,已确定HESRG基因开放阅读框(ORF)长669bp,编码222个氨基酸,包含一个核定位信号及一个亮氨酸拉链结构域,其蛋白定位在细胞核内,提示HESRG可能在人ES细胞中发挥转录因子的作用。3、该基因特异性表达于人胚胎干细胞。一旦人胚胎干细胞分化,该基因的表达则显著下调。在人胚胎干细胞过表达HESRG可促使人ES细胞向中胚层方向分化；使用化学合成siRNA干扰HESRG结果初步显不HESRG基因的表达下调后人ES细胞呈现出神经外胚层分化的表型,并表达原始神经外胚层的相关标志基因,提示HESRG基因具有抑制人胚胎干细胞的神经分化的作用,对人胚胎干细胞自我更新的维持发挥重要作用。4、HESRG的表达受Oct4(一个在胚胎干细胞自我更新机制中起重要作用的核心转录因子)的调控。除本研究组外,目前国内外尚无关于HESRG基因研究的报道。基于以上前期工作,本研究拟进一步揭示HESRG的功能并探讨其可能受到的信号通路的调控。此外,尽管我们在前期的研究工作还发现HESRG在一些常见的肿瘤细胞系如HT-29、Caski、K562、CNE-2、HEK293及THP-1等均无表达,但目前对HESRG在人类肿瘤中表达的情况尚属未知。本研究中,我们拟检测该基因在人类颅内肿瘤中的表达。鉴于在克隆HESRG的过程中,我们发现参与构成HESRG的ESTs序列BF223023源于生殖细胞类肿瘤(Germ cell tumors),提示HESRG在生殖细胞肿瘤中可能存在表达,因而我们在广泛筛选该基因在人类颅内表达情况的基础上重点关注其在颅内生殖细胞肿瘤中的表达。本研究分为以下几个部分：[人类胚胎干细胞培养鉴定及HESRG在hES细胞中表达]本课题采用的人胚胎干细胞系为H1及H9,通过RT-PCR、 Real-time PCR及免疫荧光等方法鉴定了其人类胚胎干细胞多潜能性基因Oct4、Nanog以及种属特征性基因TRA-60-1及SSEA-3的表达,结合先前的实验结果,证实了本课题采取的人胚胎干细胞培养方案能够稳定地扩增具备多潜能性的hES细胞,能够满足后续实验的要求。通过RT-PCR、real-time PCR以及免疫荧光检测HESRG在未分化的hES细胞系H1及H9中的表达,从mRNA水平及蛋白质水平验证了HESRG在hES细胞中的高水平表达。通过免疫荧光检测证实HESRG蛋白定位于hES细胞的细胞核,与本研究组此前所进行的生物信息学预测及免疫细胞化学结果一致,说明其可能作为核转录因子发挥作用。通过对比HESRG在小鼠胚胎干细胞系(Mouse embryonic stem cells, mES cells) C57/BL6以及hES细胞系H1、H9中的表达,发现HESRG仅表达于hES细胞,在mES细胞中并未检测到阳性信号,与本研究组此前研究结果及生物信息学检索结果一致,提示HESRG基因是具有种属特异性,该基因表达差异是否为人和小鼠ES细胞存在生物学行为差别的原因之一值得探讨。通过RT-PCR、 Real-time PCR及免疫荧光检测对比未分化状态(Undifferentiated status)及自发分化状态(Spontaneous differentiated status)下HESRG在hES细胞中的表达情况,发现HESRG在未分化状态的hES细胞中有高水平表达,而在自发分化状态的hES细胞中表达显著下降,提示HESRG可能是一个与hES细胞未分化状态相关的基因。[利用Si-RNA干扰技术研究HESRG在hES细胞中的功能]以Lipofectamine RNAiMAX作为转染试剂,采用特异性siRNA进行RNA干扰(RNA interference, RNAi)沉默HESRG在hES细胞中表达,进一步研究HESRG的功能。通过连续观察HESRG沉默前后hES细胞的形态学表型变化,发现HESRG沉默后hES细胞出现典型分化表型。HESRG沉默后48小时,hES细胞呈现的致密克隆形态基本消失,细胞彻底分散,并明显变得细长,呈现典型的分化细胞表型；将细胞进行连续培养,在HESERG沉默后9天,细胞呈多形性散在分布,其间富有具备长突起的双极样细胞,部分具有短突出突起的双极细胞覆盖其上,细胞呈典型神经干/祖细胞(neural stem/progenitor cells)外观。通过real-time PCR、免疫荧光检测HESRG沉默后48小时hES细胞多潜能性标志基因Oct4、Nanog、Sox2的表达情况,发现这些胚胎干细胞多潜能性标志基因的表达均明显下降,说明hES细胞在HESRG沉默后丧失其多潜能性特点；通过检测HESRG沉默后48小时原始神经外胚层标志基因Nestin、Sox1、 Musashi-1、PAX6及终末神经分化标志基因βⅢ-tubulin及GFAP,发现HESRG沉默后的细胞表达原始神经外胚层标志基因Nestin、Sox1、 Musashi-1、PAX6,不表达βⅢ-tubulin及GFAP,说明HESRG沉默后的细胞表现出神经外胚层细胞的特点。干扰后获得细胞连续培养2周后发现该细胞表达神经元特征性标记物βⅢ-tubulin。以上结果说明,HESRG沉默后的hES细胞能够沿神经谱系方向进行分化直至出现终末神经分化细胞,提示HESRG具有抑制hES细胞的神经分化的功能,也提示该基因在维持hES细胞的自我更新及多潜能性起重要作用。[WNT信号通路与HESRG]我们通过生物信息学预测发现HESRG基因的启动子区域附近存在着多个WNT信号通路转录因子LEF/TCF蛋白家族的特异性识别位点(A/T)(A/T)CAA(A/T)GG序列,提示HESRG的表达可能受到WNT信号通路的调控。鉴于目前已有较多研究证实WNT通路在人胚胎干细胞的自我更新、保持未分化状态(或多潜能性)起重要作用并在人胚胎干细胞神经分化中起重要作用,我们利用GSK-3特异性抑制剂BIO激活WNT通路,观察到BIO能有效维持hES细胞在非条件培养基培养条件下处于未分化状态,并能够使其多潜能性标志基因Oct4、Nanog在hES细胞中高表达,且其HESRG基因的表达也维持在较高水平；无BIO刺激的hES细胞在非条件培养条件下会发生自发分化,其HESRG表达也会降低。由此提示WNT信号通路可能直接或间接地维持了HESRG的高水平表达。构建带有HESRG启动子附近区域并涵盖LEF/TCF蛋白家族特异性识别位点的荧光素酶报告质粒pGL3-basic-HESRG upstream2061bp,转染该质粒并利用BIO激活WNT信号通路,发现转染pGL3-basic-HESRG upstream2061bp质粒的hES细胞具有高水平的荧光素酶活性,说明WNT信号通路可通过激活HESRG的启动子区域激活HESRG的表达。通过Real-timePCR检测LEF/TCF蛋白家族在hES细胞中的表达情况,发现TCF-3在hES细胞中表达丰度最高。利用SiRNA (siRNA)干扰技术特异性干扰TCF-3后,hES细胞在非条件培养基中在撤除外源性WNT信号的情况下其HESRG表达依然能够维持在较高水平,说明在WNT信号通路未激活的情况下TCF-3具有抑制hES细胞的HESRG的表达的作用。联合转染pGL3-basic-HESRG upstream2061bp质粒及Si-RNA-TCF-3,发现TCF-3沉默后转染pGL3-basic-HESRG upstream2061bp质粒的hES细胞在无外源性WNT信号的条件下表现出较高的荧光素酶活性,说明在无外源性WNT信号的情况下TCF-3能抑制HESRG的启动子活性。根据生物信息学预测结果设计HESRG启动子附近区域并涵盖LEF/TCF蛋白家族的特异性识别位点的PCR引物,利用染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation, ChIP)技术,证实TCF-3蛋白能直接结合于HESRG上游2000bp的DNA序列上,说明WNT信号通路对HESRG有直接调控作用。综合以上结果表明,WNT信号通路能够通过TCF-3直接作用于HESRG启动子附近区域激活HESRG基因并维持其在hES细胞中的表达。[HESRG在颅内肿瘤中的表达]我们用RT-PCR技术系统地检测了HESRG在颅内常见肿瘤中的表达分布情况。结果发现HESRG仅在颅内生殖细胞瘤及胚胎癌中有较高表达,在所检测的颅内其它肿瘤及正常脑组织中未见该基因表达。进一步用Real-time PCR证实了以上结果。之后,采用免疫组织化学法检测了HESRG在颅内非生殖细胞类肿瘤及生殖细胞类肿瘤中的表达情况,发现HESRG在生殖细胞瘤及胚胎癌肿瘤的肿瘤细胞胞核中有较强表达,在其它类型的肿瘤中未见表达。在31例生殖细胞瘤中,25表现出强阳性,4例呈中等阳性,2例呈弱阳性；在9例胚胎癌中,6例呈强阳性表达,3例呈中等阳性表达。通过文献对比其它生殖细胞类肿瘤的标志物基因,我们发现HESRG是诊断颅内生殖细胞瘤及胚胎癌的一个既敏感又特异的标志基因。总之,通过以上研究,我们得到以下结论：1、人胚胎干细胞存在HESRG基因表达,小鼠胚胎干细胞未见HESRG表达；HESRG蛋白定位于细胞核；人胚胎干细胞分化后其HESRG基因表达下调。2、HESRG基因是一个维持人胚胎干细胞未分化状态、参与其自我更新的重要基因,通过RNAi技术抑制该基因表达,可使人胚胎干细胞向原始神经外胚层分化。3、HESRG基因的表达受WNT信号通路调控。利用GSK-3特异性抑制剂BIO激活WNT通路,能维持人胚胎干细胞处于未分化状态,并使人胚胎干细胞的HESRG的表达处于较高水平；无BIO刺激的hES细胞在非条件培养条件下会发生自发分化,其HESRG表达也会降低。WNT信号通路能够通过TCF-3直接作用于HESRG启动子附近区域激活HESRG基因并维持其在hES细胞中的表达。4、在RNA水平及蛋白质水平,颅内生殖细胞瘤及胚胎癌均表达HESRG,而颅内其它肿瘤及正常脑组织均未见该基因表达。HESRG是诊断颅内生殖细胞瘤及胚胎癌的一个既敏感又特异的标志基因。本研究的创新性：除本研究组外,目前国内外尚未见有关HESRG基因研究的报道。1、本研究用进一步实验验证了本研究组其他成员此前的如下研究结果(目前国内外均未见其它研究组的相关报道)：人胚胎干细胞存在HESRG基因表达,而小鼠胚胎干细胞未见HESRG表达；(?)HESRG蛋白定位于细胞核；人胚胎干细胞分化后其HESRG基因表达显著下调；HESRG基因是一个维持人胚胎干细胞未分化状态、参与其自我更新的重要基因,通过RNAi技术抑制该基因表达,可使人胚胎干细胞向原始神经外胚层分化。2、本研究首次研究了HESRG基因与WNT通路的关系,采用多种研究方法首次发现HESRG基因的表达受WNT信号通路调控。3、本研究首次研究了中枢神经系统肿瘤中HESRG基因的表达,首次发现颅内生殖细胞瘤及胚胎癌表达HESRG,而颅内其它肿瘤均未见该基因表达,首次提出HESRG是诊断颅内生殖细胞瘤及胚胎癌的一个既敏感又特异的标志基因。本研究的意义：1、进一步证实本研究组前期克隆的一个人类新基因HESRG在胚胎干细胞的表达情况及其在维持人胚胎干细胞未分化状态、参与其自我更新的作用,验证了其具有抑制人胚胎干细胞神经分化的作用。这对于进一步研究HESRG基因的功能、探讨人胚胎干细胞自我更新及分化机制可能具有重要意义。2、WNT信号通路是人胚胎干细胞自我更新及神经分化机制中的重要通路,本研究首次发现HESRG基因的表达受WNT信号通路调控。这对进一步明确人胚胎干细胞中WNT信号通路调节的靶基因、HESRG基因表达调控机制、深入探讨人胚胎干细胞自我更新及分化机制可能具有科学价值。3、首次研究了颅内肿瘤中HESRG基因的表达,首次提出HESRG是诊断颅内生殖细胞瘤及胚胎癌的一个既敏感又特异的标志基因。这对于颅内生殖细胞瘤和胚胎癌的分子诊断可能具有重要意义,同时也为进一步深入研究HESRG基因对人类生殖细胞瘤及胚胎癌的生物学行为的影响可能提供有价值的线索。4、鉴于人胚胎干细胞在研究人类胚胎发育及细胞分化机制的方面的重要作用,本研究可能对进一步明确人类胚胎神经组织的发育和分化的分子机制提供线索。5、本研究观察到通过抑制HESRG基因的表达可以实现人胚胎干细胞向神经谱系分化,这可能对进一步探讨未来利用人胚胎干细胞或iPS细胞等多能干细胞实现人类神经组织再生或移植,解决人类神经系统疾患的治疗难题带来帮助。