牛结核病主要是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)引起的一种人兽共患传染病。该病呈慢性经过，主要经呼吸道和经口感染。排菌的重症病牛是本病的主要传染源。该病在世界各国都有发生，尤其是近年来，随着结核菌耐药菌株的产生及个体养牛户的增加，牛结核病的疫情呈逐年上升趋势。该病的传播流行给世界养牛业造成了巨大经济损失，至今牛结核病所造成的损失大于牛的其他各种疾病所造成损失的总和。同时由于牛结核病也可传染给人，从而给人类公共卫生安全造成了严重隐患，因此采取一切措施防治牛结核病刻不容缓。由于目前牛结核病没有有效的疫苗进行预防，许多国家主要采用不免疫，加强检疫，阳性牛一律扑杀的原则来实现牛结核病的控制。因此准确而及时的诊断方法对于该病的防治显得尤为重要。 目前对于牛结核病的检测，世界动物卫生组织(Office International Des Epizooties，OIE)唯一推荐的方法是牛型结核菌素皮内变态反应(Tuberculin skin test，TST)，但该方法存在严重的非特异性反应及对重症牛的低反应力。结核菌素纯化蛋白衍化物(Protein purified derivative，PPD)用于间接酶联免疫吸附方法(Enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)检测结核抗体也被尝试过，但由于PPD是一种成分复杂的蛋白混合物，除了含有牛分枝杆菌特异性分泌抗原外，还含有许多其他分枝杆菌具有的类属抗原，因此交叉反应无法避免，而且早期感染牛多数抗体水平较低。鉴于以上情况，探索一种特异、敏感的检疫方法是控制牛结核病的当务之急。 MPB70、MPB83、CFP10和ESAT-6是牛分枝杆菌特异性抗原，许多研究已经证实是非常有前景的鉴别诊断候选抗原。本研究采用这四种抗原建立了检测牛结核病的间接ELISA方法，旨在为临床结核病的诊断提供一种特异性，敏感性和实用性都比较理想的诊断试剂，为我国牛结核病的防控提供技术支持。主要研究内容包括： 1．PPD-ELISA方法的优化 本研究在前人工作的基础上对PPD-ELISA的封闭液，血清稀释液，酶标二抗稀释液，底物作用时间，终止液的选择及阴阳判定等方面作了改进。改进后的ELISA阴性背景降低，血清稀释液简化，酶标二抗利用效率提高，结果判定更加科学。 2．ELISA检测牛奶中结核病抗体的探讨 保存期试验显示，牛奶样品在4℃放7d，-20℃存放15d以上不影响ELISA检测结果。但牛奶反复冻融对抗体效价影响很大。ELISA检测牛奶与检测血清比较，两者有90.8％的符合。 3．牛结核特异性抗体ELISA检测方法的建立 借鉴优化后的PPD-ELISA程序，分别建立了CFP10-ESAT6-ELISA、MPB70-ELISA和MPB83-ELISA，各抗原包被浓度分别为600ng／mL，100ng／mL和