卵粘蛋白(ovomucin)是禽蛋蛋清中的一种高分子量硫酸酯糖蛋白,占蛋清蛋白质2%~4%。生物体内粘蛋白具有一定的抑菌活性,蛋清中卵粘蛋白与生物体内粘蛋白有同源性,作为粘蛋白家族的一员,现有关卵粘蛋白抑菌活性的报道并不多见,本文以鸡蛋中的卵粘蛋白为研究对象,以禽蛋中常见微生物金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌及致龋齿的变异链球菌为实验菌种,探究卵粘蛋白对这些微生物的抑菌活性,并进一步研究其抑菌机理。主要研究内容与结果如下:采用聚乙二醇(PEG)与Mg Cl2等电点盐析相结合的方法对鸡蛋蛋清中卵粘蛋白进行提取,探讨PEG提取卵粘蛋白的最佳条件。实验结果表明,首先采用蛋清与水体积比为1:2、PEG分子量为8000、浓度2%(质量比)将蛋清中的卵粘蛋白沉淀下来;再经0.05mol/L Mg Cl2等电点沉淀进一步除去杂蛋白,制得粗品卵粘蛋白,SDS-PAGE电泳和凝胶过滤层析显示粗卵粘蛋白中主要的杂蛋白依次为卵转铁蛋白、卵白蛋白、卵类黏蛋白和少量溶菌酶,其纯度为87%左右,得率80%左右。通过卵粘蛋白的抑菌活性及其抑菌稳定性实验结果表明:卵粘蛋白对金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、变异链球菌的MIC分别为62.5μg/m L、125μg/m L、1000μg/m L,出现明显的抑菌圈产生,对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌的抑制作用较差,无明显抑菌圈。以金黄色葡萄球菌为受试菌,探讨温度、p H和金属离子对卵粘蛋白的抑菌稳定性实验结果表明:在20℃、25℃和40℃温度时,低温(20℃和25℃)有利于卵粘蛋白抑制金黄色葡萄球菌的生长繁殖;此外,同一温度下蛋白质浓度越高其抑菌性能越好。卵粘蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌性随p H变化而有所不同,与中性p H为7,卵粘蛋白在酸性或碱性条件下抑菌性均有所增加。金属离子Na+、K+、Ca2+、Mg2+在0.05mol/L~0.20mol/L浓度范围内对卵粘蛋白抑菌活性无显著性影响;Cu2+、Zn2+、Mn2+均在低浓度(0.05mol/L)时表现出增强卵粘蛋白抑菌活性的作用,高浓度下对抑菌性没有或只有微弱的促进作用。Fe3+仅在0.05mol/L时表现出增强抑菌活性。考察卵粘蛋白对金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、变异链球菌的抑菌机制。实验结果显示,卵粘蛋白对菌体生长起到延缓对数期或缩短稳定期的作用,改变菌体细胞膜的通透性。扫描电镜结果显示,卵粘蛋白使菌体细胞形态发生变化,细胞膜损伤或者破坏。由此可见,卵粘蛋白通过对菌体细胞膜造成损害而发挥其抑菌活性。接着,为了解卵粘蛋白酶解产物的抑菌活性,以胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶水解卵粘蛋白,实验结果表明,4mg/m L卵粘蛋白经胃蛋白酶酶解和2mg/m L时经胰蛋白酶酶解所得酶解产物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为(11.57±0.41)mm、(11.41±0.24)mm,而三种蛋白酶酶解产物对腐生葡萄球菌、变异链球菌均无抑制作用。紫外光谱扫描结果显示,卵粘蛋白经蛋白酶酶解形成多肽,小分子肽增加,酶解液在220nm左右的吸收峰相对较强。以胰蛋白酶为制备抑菌活性的酶解产物用酶进行酶解条件优化,表明在卵粘蛋白底物浓度为2mg/m L,胰蛋白酶酶用量[E]/[S]5%(质量比)、酶解时间4h、酶解温度45℃时卵粘蛋白酶解产物的抑菌活性最高。SDS-PAGE电泳和凝胶过滤层析显示,该酶解产物分子质量主要分布在10k Da至15k Da之间。胰蛋白酶酶解产物对金黄色葡萄球菌的抑菌动力曲线显示酶解产物通过增加菌体的适应期、缩短菌体生长的对数生长期起到抑菌作用。为揭示卵粘蛋白结构与抑菌活性之间的关系,采用SDS、β-巯基乙醇及超声波处理裂解卵粘蛋白,再经凝胶过滤层析分离纯化得到亚基,采用β-消除反应释放得到的卵粘蛋白O-糖链,研究亚基和糖链的抑菌活性。实验表明卵粘蛋白亚基和糖链对金黄色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、变异链球菌无抑菌圈产生,推测亚基和糖链无明显的抑菌效果,同时通过测定菌体生长动力曲线进一步确认了该实验现象。由此实验表明卵粘蛋白解离后组分的抑菌活性急剧降低或消失。