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目的:
制备鼻咽癌细胞表面的标志性抗原潜伏膜蛋白1(Latentmembrane protein1,L,MP1)靶向纳米铁对比剂,并分析靶向纳米铁对比剂对人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型MR分子成像的效果及其意义。
材料与方法:
1.应用共沉淀法制备LMP1靶向对比剂,第一步:由FeSO4·7H2O和FeCl3·6H2O共反应得到纳米Fe3O4;第二步:加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane,APTES),使Fe3O4备表面氨基化,得到Fe3O4-APTES;第三步:将LMP1抗体HA3加入Fe3O4-APTES磁流体中,冰浴过夜,得到LMP1靶向对比剂FeSO4-APTES-H4A3。并对其进行表征检测。
2.将CNE1-LMP1(细胞膜表面LMP1表达阳性的人鼻咽癌细胞株CNE1)细胞与CNE1(细胞膜表面LMP1表达阴性的人鼻咽癌细胞株CNE1)细胞均调至1×104/ml×105/ml,1×106/ml,1×107/ml,并加入Fe3O4-APTES-H4A3(调至Fe浓度至20ug/ml)共孵育,再进行普鲁士蓝染色观察、MRI扫描及透射电镜检查。观察信号变化特征,探索LMP1靶向对比剂对CNE1-LMP1细胞的靶向效应。
3.构建人鼻咽癌皮下双移植瘤裸鼠模型,方法如下:抽取0.2ml.CNE1-LMP1细胞悬液(密度为1×107/ml),于裸小鼠右侧胸壁皮下缓慢推注;再同样抽取0.2 ml CNE1细胞悬液(密度为1×107/ml),于裸小鼠左侧胸壁皮下对称位置缓慢推注。
15只裸鼠参与制模,其中14只裸鼠双瘤模型建模成功(成瘤率93.3％),获得28枚移植瘤肿块,将其分成2组:实验肿块14枚,由CNE1-LMP1细胞株形成,位于裸鼠右侧胸壁皮下;对照肿块14枚,由CNE1细胞株形成,位于同一只裸鼠左侧对称的胸壁皮下。经裸鼠尾静脉注入Fe3O4-APTES-H4A3并行MR扫描检查,测量增强检查前后肿块的MRI信号强度、计算肿块的信号变化率。每一枚肿瘤信号强度具体的测定方法为:选择5个大小一致的感兴趣区域(region ofintrest,ROI),ROI的测定范围包括肿瘤的全部区域、边缘区以及中央区,尽量选择MRI信号均匀区域,测量并记录信号强度,然后取其平均值,并计算信号变化率(△SI),△SI=(Sipost-Sipre)/Sipost×100％,其中Sipost为注入靶向对比剂之后的鼻咽癌移植瘤肿块信号强度,Sipre为MRI平扫时鼻咽癌移植瘤肿块的信号强度。将所得数据结果16.0SPSS统计软件进行统计分析。剥取移植瘤肿块,制成切片,行免疫组化染色和普鲁士蓝染色检查。
结果:
1.对Fe3O4-APTES-H4A3的表征检查显示,直径约28±3nm,形态规整,分散均匀,X线衍射分析(X-ray diffraction,XRD)特征波峰及波形符合Fe3O4特征,具备超顺磁性。
2.体外实验结果显示:
普鲁士蓝染色显示CNE1-LMP1细胞内可见大量蓝色铁颗粒存在,CNE1细胞内蓝色铁颗粒明显减少;
体外MRI成像显示CNE1-LMP1细胞与Fe3O4-APTES-H4A3共孵育后T2WI信号强度降低,并随着细胞数量级的增加T12WI信号呈递减趋势,具有统计学意义;CNE1细胞与Fe3O4-APTES-H4A3共孵育后T2WI信号强度亦降低,同时也随着细胞数量级的增加T2WI信号梯减,但不具有统计学意义。
3.动物实验结果:
人鼻咽癌皮下双移植瘤裸鼠模型构建成功。体内水平MRI成像结果显示,注射LMP1靶向对比剂(Fe3O4-APTES-H4A3)后CNE1-MP1移植瘤T2WI强度及信号变化率均有明显下降,具有统计学意义。并计算得出Fe3O4-APTES-H4A3对于CNE1-LMP1移植瘤肿块的敏感度Sen=85.7％,特异度Spe=71.4％。CNE1移植瘤肿块T2WI信号强度未见明显改变。
病理学检查:免疫组化染色证实所建立的裸小鼠动物模型符合人鼻咽癌细胞。普鲁士蓝染色显示CNE1-MP1移植瘤肿块组织内见大量蓝染的铁颗粒,而对照组几乎未见铁颗粒的存在。
结论:
1.通过共沉淀法可构建针对鼻咽癌细胞标志性抗原LMP1的靶向MR对比剂Fe3O4-APTES-H4A3;
2.构建的鼻咽癌潜伏膜蛋白靶向纳米铁MR对比剂(Fe3O4-APTESH4A3)对CNE1-LMP1细胞具备一定的靶向性。
3.构建的鼻咽癌潜伏膜蛋白靶向纳米铁MR对比剂(Fe3O4-APTES-H4A3)对CNE1-LMP1移植瘤具备良好的靶向性显示功能。