纳米粒(nanoparticle)是由天然或合成的高分子材料制成的、粒度在纳米级别(1-1000nm)的固态胶体颗粒体系。在纳米给药系统中,药物高度分散于由高分子材料形成的纳米尺度的球状结构中,依靠药物自身的性质以及载体材料的特性发挥该给药系统特有的优势。特别对于包载难溶性药物的口服纳米给药系统的研究而言,除了有效的保护药物免受胃肠道环境的影响以及提高药物的溶解度以外,纳米给药系统能够跨越口服吸收的粘膜上皮细胞屏障,起到有效提高口服生物利用度的作用。尽管目前纳米技术发展迅速,有效促进了难溶性药物的吸收与转运,但是关于纳米给药系统的具体摄取及跨膜转运作用机理研究较少。　　本课题以纳米给药系统作为研究对象,建立上皮细胞单层跨膜转运模型,综合分析纳米给药系统在细胞表面的吸附,被细胞内吞及跨膜转运机制。　　本课题选择MDCK细胞和Caco-2细胞共同作为模型细胞系,并建立跨膜转运模型。MDCK细胞与Caco-2细胞是目前药物及制剂研究中常用模型细胞系。由于二者都具有极性上皮细胞共有的结构特点,同时细胞单层顶膜上均存在多种表面受体蛋白的表达,因此MDCK细胞和Caco-2细胞可以用于有效模拟药物或制剂经过极性上皮细胞屏障的过程以研究其吸收与跨膜转运机制。同时本课题选取目前具有应用广泛性、生物可降解性和生物相容性的PLGA作为载体材料,并将其制备成PLGA纳米粒用于细胞内吞、外排及跨膜转运机理等的研究。　　本课题通过乳化溶剂挥发法制备了PLGA纳米粒,通过单因素分析确定了用于研究的粒径范围及多分散性。同时本课题以香豆素-6(C6)为荧光标记染料,将其包载于PLGA纳米粒中,制备得到了包载有香豆素-6的PLGA纳米粒(C6-PLGA-NPs)。通过体外泄漏分析以及细胞摄取后荧光强度的比较证明经C6-PLGA-NPs可以通过荧光定位及定量很好的指示纳米粒的内吞、外排与跨膜转运过程。　　在PLGA纳米粒与MDCK细胞单层表面的吸附研究中,可以发现PLGA纳米粒大量吸附于MDCK细胞表面,同时这种吸附作用具有不均一性。由于纳米粒的吸附作用,细胞的表面形态以及微绒毛的分布发生明显改变。利用荧光漂白恢复技术(FRAP)发现PLGA纳米粒在细胞表面的吸附可以降低细胞质膜的流动性。同时本课题通过薄膜分散法制备了含有卵磷脂以及胆固醇的大多囊脂质体,用以模拟细胞质膜的磷脂双分子层。差示扫描量热(DSC)发现PLGA纳米粒显著改变了人工细胞的能量变化曲线,表明纳米粒的吸附于内吞作用能够改变质膜双分子层中磷脂分子的排列状态,进而引起能量变化差异。　　在PLGA纳米粒在MDCK细胞中内吞及外排机制研究中,发现纳米粒能够以大小不同的囊泡形式被细胞摄取,这种摄取作用具有时间依赖性和能量依赖性。胞内分布发现,纳米粒会随着内吞时间的延长从细胞顶膜向基底膜转移。纳米粒的内吞作用导致了细胞微丝分布的改变以及胞内Ca2+浓度增加。内吞机理研究表明 PLGA纳米粒的内吞以脂质微囊和网格蛋白共同介导,同时受多种胞内相关激酶的调节。C6-PLGA-NPs与胞内细胞器的共定位分析表明纳米粒内吞入胞后会从早期内吞体向晚期内吞体迅速转化,并最终与溶酶体融合。　　PLGA纳米粒被MDCK细胞内吞的同时也会被细胞外排。机理分析表明纳米粒的外排机制不同于内吞作用。高尔基体在纳米粒的外排中发挥重要作用。　　本课题利用transwell培养板建立了MDCK细胞跨膜转运模型。纳米粒可以跨越细胞单层,但是难以通过 transwell膜孔而到达下层接收池中,反映出纳米粒经由细胞单层的跨膜转运是主动转运过程。纳米粒在跨膜过程中会造成部分胞间连接的打开,使部分纳米粒可以通过细胞旁路途径跨膜。机理分析表明在内吞与外排的不同条件下,纳米粒的跨膜转运呈现不同的机制。　　本课题对PLGA纳米粒在Caco-2细胞中的内吞及跨膜转运进行了研究。纳米粒的内吞作用具有时间、浓度及能量依赖性。内吞途径同样受到脂质微囊和网格蛋白的共同介导。与MDCK细胞研究类似,纳米粒内吞入胞后也会经历由早期内吞体向晚期及循环内吞体转化的过程。跨膜转运结果表明,相比于 MDCK细胞,纳米粒更难跨越细胞单层及 transwell膜而到达接收池内。机制分析显示Caco-2细胞单层胞间连接受 PLGA纳米粒的影响小,表明纳米粒通过穿细胞途径跨膜出胞。　　综上所述,通过研究PLGA纳米粒与MDCK及Caco-2细胞单层的相互作用、内吞、外排和跨膜机制,发现PLGA纳米粒能够通过在细胞表面的吸附引起细胞表面形态及质膜功能的变化。纳米粒的内吞受到多种途径的共同介导,并具有多样性的细胞器定位特点。不仅如此,PLGA纳米粒对细胞紧密连接致密程度不同的细胞可产生不同的影响,转运机制也有所不同。PLGA纳米粒可以通过穿细胞途径和细胞旁路途径经MDCK细胞单层跨膜出胞。对于Caco-2细胞,穿细胞途径则为PLGA纳米粒唯一的跨膜转运方式。