研究目的:乳腺癌是当今世界女性最常见的恶性肿瘤,根据2018世界癌症数据报告,2018年有将近210万新确诊的女性乳腺癌病例,约占女性癌症病例的四分之一。乳腺癌是一种高度异质性的肿瘤,主要诱发原因可能与家族遗传因素,不良的生活饮食习惯,生育较晚或不育等有关。早在19世纪,就有学者提出乳腺癌为一种全身性疾病。乳腺癌在早期阶段便可以通过血液途径或淋巴途径转移到人体内其他的器官或组织。早期时代乳腺癌的临床治疗模式是以手术为主,后续辅助放射治疗,细胞毒性治疗,内分泌治疗等。而现在乳腺癌的诊断和治疗手段得到了极大地丰富,包括21基因检测,新辅助化疗,靶向药物治疗等。其中,新辅助化疗已经被广泛地应用于临床治疗当中。治疗手段的层出不穷意味着患者有了更多的治疗方案可供选择。为了提供给个体化差异较强的乳腺癌患者更加精准恰当的治疗方案,提高他们的生活质量和改善预后情况。我们迫切需要找寻能够验证治疗效果和具有预后作用的生物学指标。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,Lnc RNAs）,是长度大于200个核苷酸的非编码RNA。早期阶段,由于Lnc RNAs不具备编码蛋白质的能力,人们将其认为是无意义序列。但是随着研究的进展,人们发现Lnc RNA在剂量补偿效应（Dosage compensationeffect）、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用,目前已经成为研究热点。最新研究证据表明,Lnc RNA是肿瘤发生和发展的一种关键调控因子,可以起到原癌基因或抑癌基因的作用。由于Lnc RNA的表达经常在肿瘤中失衡,因此它对肿瘤患者的诊断和预后具有重要意义,同时也是潜在的肿瘤生物学标志物。在本项研究中,通过对LINC数据库进行了挖掘,我们发现了本次实验的目标LINC02544。LINC02544在乳腺癌组织中特异性高表达。我们研究了LINC02544在乳腺癌MCF-7细胞系以及人体乳腺癌组织中的表达情况及其分子生物学功能。并且就LINC02544在乳腺癌患者进行新辅助化疗前后的表达差异,以及这种差异对预后的影响进行了分析。在研究发现新辅助化疗后残存肿物的LINC02544的高表达与HR阳性的乳腺癌患者不良预后相关后,我们继续对与LINC02544是否与内分泌治疗抵抗相关进行了探究。本次研究的目标是确定LINC02544在新辅助化疗后乳腺癌的行为和预后中的作用。实验方法:一、挖掘数据库Lnc AR,确定研究目标LINC02544二、验证LINC02544在MCF-7乳腺癌细胞系中生物学行为影响1、根据LINC02544序列,分别构建过表达和敲减LINC02544的载体,感染乳腺癌细胞系MCF7后筛选稳定转染的细胞;利用荧光显微镜和real-time PCR分别定性和定量检测病毒转染效率,成功构建稳定过表达和敲减LINC02544的MCF7乳腺癌细胞系;2、通过划痕愈合实验检测LINC02544对MCF7乳腺癌细胞系的迁移能力的影响3、通过EDU实验检测LINC02544对MCF7乳腺癌细胞系的增殖能力的影响4、通过Transwell侵袭实验检测LINC02544对MCF7乳腺癌细胞系的侵袭能力的影响;三、探索LINC02544的二级结构,进行KEGG富集分析四、分析LINC02544表达水平与临床病理特征的相关性1、分别收集来自中国医科大学附属第一医院的147例接受新辅助化疗前后的乳腺癌患者组织蜡块,利用TRIzol法提取组织的总RNA,逆转录PCR法进行反转录;2、采用real-time PCR实时定量检测组织与细胞中的LINC02544表达水平。3、应用SPSS 19.0和Graphpad 8.0进行统计学分析,通过t检验,卡方检验的等手段,分析新辅助化疗前后乳腺癌组织中LINC02544的表达量的差异以及其与临床病理资料间的相关性。五、探索LINC02544与乳腺癌患者生存预后的相关性1、将乳腺癌患者肿物中的LINC02544的表达量以中位数为分界,分为高表达和低表达组进行比较2、利用Graphpad 8.0分别绘制新辅助化疗前和新辅助化疗后,高表达和低表达两组的生存曲线,观察是否具有统计学差异3、利用Graphpad 8.0分别绘制根据乳腺癌患者分子分型分组,高表达和低表达两组的生存曲线,观察是否具有统计学差异六、探索LINC02544的高表达是否与新辅助化疗后有残存肿物患者的内分泌治疗抵抗相关1、构建两组对比:在MCF-7细胞中瞬时转染LINC02544（+）质粒有效提高LINC02544的表达,而对照组的LINC02544在MCF-7中的表达没有明显影响2、分别在实验组和对照组的MFC-7细胞系中,给予三种药物处理:单独使用他莫昔芬TAM,他莫昔芬TAM+依维莫司Everolimus和他莫昔芬TAM+帕博西尼Palbociclib。观察实验组与对照组的细胞生长情况,进行记录比对。实验结果:一、LINC02544表达在Lnc AR数据库中的结果1、LINC02544的表达水平,在乳腺癌、肺癌（Lung cancer）等癌种中表达上调,而在尿路上皮癌（Urothelial cancer）、食管腺癌（Esophagel adenocarcinoma）、浆液性卵巢癌（Serous ovarian cancer）等癌种中表达下调。2、数据库中以Log2FC的cutoff值的绝对值大于1、p值至少小于0.01为条件,发现LINC02544在乳腺癌患者中显著高表达,p<0.001。3、在预后方面,LINC02544低表达组相较于高表达组有明显的更好生存趋势,但结果没有达到统计学差异,Hazard ratios=1.45 log-rank p值=0.351。4、分别比较了LINC02544在几种乳腺癌亚型中的表达差异。在三阴性乳腺癌组织中,LINC02544的表达水平上调较为明显p=0.002,而且高表达组与低表达组的生存差异也更加突出,Hazard ratios=1.98 log-rank p值=0.07。二、过表达LINC02544对乳腺癌细胞生物学功能表型的影响1、经稳定转染,real-time PCR检测在过表达LINC02544的MCF-7细胞系中LINC02544上调20.1±2.4倍（P<0.01）2、划痕愈合实验中,过表达LINC02544组相较于对照组,划痕愈合速度显著增加（P=0.03）3、EDU实验中,过表达LINC02544组相较于对照组,肿瘤细胞增殖数量显著增加（P<0.01）4、Transwell侵袭实验中,过表达LINC02544的实验组通过膜的平均细胞数量为206±15,而对照组通过膜的平均细胞数量为140±11,实验组肿瘤细胞迁移速度显著加快（P=0.02）三、敲减LINC02544对乳腺癌细胞生物学功能表型的影响1、经稳定转染,real-time PCR检测在过敲减LINC02544的MCF-7细胞系中LINC02544下调0.35±0.11倍（P<0.01）2、划痕愈合实验中,敲减LINC02544组相较于对照组,划痕愈合速度显著减缓（P=0.02）3、EDU实验中,敲减LINC02544组相较于对照组,肿瘤细胞增殖数量显著下降（P=0.01）4、Transwell侵袭实验中,敲减LINC02544的实验组si-1通过膜的平均细胞数量为80±10,实验组si-2通过膜的平均细胞数量为78±11,而对照组通过膜的平均细胞数量为160±14。实验组肿瘤细胞迁移速度显著减缓（P<0.01）四、LINC02544的表达与乳腺癌临床病理特征的关系1、新辅助化疗前,组织学分级为1-2级患者的肿物LINC02544的表达量为3.45±1.32;组织学分级为3级患者的肿物LINC02544的表达量为4.59±1.11。在接受新辅助化疗后,组织学分级1-2级患者的残存肿物LINC02544的表达量3.73±1.00;组织学分级3级患者的残存肿物LINC02544的表达量为4.89±1.10。无论是新辅助化疗前（P=0.02）还是新辅助化疗后（P=0.01）,LINC02544的高表达量与高组织学分级有显著相关性,且结果具有统计学意义2、新辅助化疗前的,三阴性乳腺的患者LINC02544的表达量为4.39±1.51,而非三阴性乳腺癌的患者表达量为3.13±1.04,两组患者的差异具统计学意义p<0.01。新辅助化疗后,三阴性乳腺的患者LINC02544的表达量为4.76±1.52,而非三阴性乳腺癌的患者表达量为3.87±0.87,两组患者的差异同样具统计学意义p<0.01。即可得出,LINC02544的高表达与三阴性乳腺癌存在相关性。3、新辅助化疗前,c N0-1组标本LINC02544的表达量为3.20±1.10;c N2-3组标本LINC02544的表达量为3.52±1.21。显然两者不具备统计学差异P=0.21。在接受新辅助化疗后,c N0-1组标本LINC02544的表达量为3.27±0.86;c N2-3组标本LINC02544的表达量为4.32±1.22。两组数据具备统计学差异P<0.014、新辅助治疗前,患者样本LINC02544平均表达量为3.04±0.93;新辅助治疗后,患者样本LINC02544平均表达量为4.08±1.45,两者之间的差异具有统计学意义P<0.01。新辅助治疗后,LINC02544的表达量显著上升5、新辅助化疗前,根据免疫组化进行分子分型分组,HR+HER2-组LINC02544的表达量平均值为3.00±1.06;HR+HER2+组LINC02544的表达量平均值为3.40±1.36;HR-HER2-组LINC02544的表达量平均值为3.28±0.85;TNBC组LINC02544的表达量平均值为4.61±1.34。三阴性乳腺癌LINC02544的表达量显著高于其他组乳腺癌患者的表达量（TNBC vs HR+HER2-P<0.001;TNBC vs HR+HER2+P=0.002;TNBC vs HR-HER2-P<0.001）。五、LINC02544的表达与乳腺癌预后的关系1、新辅助化疗后,LINC02544高表达和低表达的两组在DFS,DRFS还是在OS中,均具有显著差异,且差异具有统计学意义（DFS P=0.03;DRFS P=0.03;OS P=0.04）。新辅助化疗后未达到PCR患者的肿瘤组织中LINC02544的表达量与乳腺癌的预后相关,且高表达与乳腺癌预后不良相关。2、新辅助化疗后的单因素分析中,LINC02544的高表达在OS和DFS上与乳腺癌不良预后相关,且具有统计学意义（DFS P=0.03;DRFS P=0.053;OS P=0.039）。联合多因素分析中LINC02544的高表达也与乳腺癌不良预后相关,但仅有OS具有统计学意义（DFS P=0.053;DRFS P=0.054;OS P=0.046）。3、新辅助化疗前,LINC02544低表达组相较于LINC02544高表达组无论是在总体生存率还是无病生存率上均有较好的预后表现,但这种差异趋势不具备统计学意义（DFS P=0.43;DRFS P=0.21;OS P=0.13）。4、针对HR+的乳腺癌患者,新辅助化疗后,残存肿瘤LINC02544高表达在DFS上与乳腺癌患者不良预后相关,且具有统计学意义（DFS P=0.04;DRFS P=0.12;OS P=0.08）。六、LINC02544的表达与乳腺癌内分泌治疗抵抗的关系1、构建稳定高表达LINC02544的实验组及空白载体对照组2、分别采用:单独使用他莫昔芬TAM,他莫昔芬TAM+依维莫司Everolimus和他莫昔芬TAM+帕博西尼Palbociclib三组进行对照。仅给予单一药物TAM的情况下,高表达LINC02544的MCF-7细胞系相较于对照组,细胞生长更快更多;但是在联合了EVE或PAL的情况下,高表达LINC02544的实验组的MCF-7细胞的生长也同对照组一样受到了抑制。研究结论:1、LINC02544在乳腺癌组织中与癌旁非癌组织相比显著高表达2、敲降LINC02544会抑制MCF-7乳腺癌细胞系增殖,侵袭和迁移3、LINC02544高表达会促进MCF-7乳腺癌细胞系增殖,侵袭和迁移4、LINC02544在乳腺癌细胞中的表达量与组织学分级和分子亚型相关5、乳腺癌患者接受新辅助化疗后,残存肿瘤的LINC02544的表达量会上升6、新辅助化疗后残存肿瘤LINC05244的高表达与不良预后相关,尤其是HR+乳腺癌患者中,相关性更加显著7、新辅助化疗后残存肿瘤LINC05244的高表达与内分泌治疗抵抗相关,但是联合多种内分泌药物治疗可抑制这种抵抗