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布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的危害严重的人畜共患病。近年来，我国动物布病的发病率有所回升。当前控制布病的关键问题是布鲁氏菌致病机制和宿主抵抗布鲁氏菌感染机制不完全清楚。但至今，有关羊抵抗布鲁氏菌感染机制的研究报道较少。强毒株感染导致机体患病，弱毒株感染对机体起到保护作用却不引起患病，说明不同毒力株布鲁氏菌感染可引起机体产生不同的应答反应。因此，比较研究不同毒力株感染机体产生的不同应答分子，能够为预防、治疗、检测布鲁氏菌病提供靶标分子。布鲁氏菌可分为6个种。其中，羊种布鲁氏对我国危害较大。在众多布病疫苗中，猪种布鲁氏菌减毒疫苗S2在我国使用较为广泛。因此，选择羊种布鲁氏菌强毒株和猪种布鲁氏菌弱毒株S2进行比较具有一定的代表性，比较结果更加具有现实意义。为获得布鲁氏菌强弱毒株感染小尾寒羊差异表达基因，本项研究应用抑制性差减杂交(SSH)技术构建布鲁氏菌强弱毒株感染小尾寒羊SSH cDNA文库。采用鸟枪法对447个文库细菌克隆进行测序。利用荧光定量PCR证实免疫相关备选基因CD96基因在羊种布鲁氏菌(B. melitensis)攻毒小尾寒羊第44天的外周血白细胞层中上调表达。应用RACE技术扩增得到CD96基因全长cDNA序列，并利用生物信息学软件预测CD96-DNAX-1蛋白的抗原表位。通过腹水诱生法获得CD96-D1单克隆抗体。验证了小尾寒羊CD96分子与TNF、IL-10、IFN-γ和IL-4的分泌关系。1、布鲁氏菌强弱毒株感染小尾寒羊SSH cDNA文库为获得布鲁氏菌强弱毒株感染小尾寒羊差异表达基因，本研究以雄性小尾寒羊为对象，以羊种布鲁氏菌(B. melitensis)为攻毒菌、以猪种布鲁氏菌减毒疫苗株(Brucellosis Vaccine, Live, S2)为接种菌，利用SSH技术首次成功构建布鲁氏菌强弱毒株感染小尾寒羊白细胞层SSH cDNA文库，该文库容量为1.62×106cfu。2、克隆获得240个小尾寒羊外周血白细胞层表达基因采用鸟枪法对447个文库细菌克隆进行测序，经序列分析和拼接，共得到240个小尾寒羊外周血白细胞层表达基因，其中有4个rRNA基因，234个cDNA序列。在234个cDNA序列中，有32个cDNA翻译的氨基酸序列可以搜索到保守结构域，占总数240个功能基因的比例为13.7%。3、确定CD96基因上调表达并获得CD96基因cDNA序列为验证CD96基因差异表达的特性，利用荧光定量PCR证实CD96基因在羊种布鲁氏菌(B. melitensis)攻毒小尾寒羊第44天的外周血白细胞层中上调表达，在S2接种后44天的外周血白细胞层中上无显著变化。为获得CD96基因cDNA序列，利用RACE技术扩增得到CD96基因全长cDNA序列。预测氨基酸序列具有PolyA结构和加尾信号序列，所编码蛋白无信号肽，表达于细胞膜表面。4、预测CD96-DNAX-1蛋白的抗原表位并获得CD96-D1单克隆抗体利用spdbv4.1.0预测CD96-DNAX-1蛋白的三维结构，发现该结构比较松散，与抗体嵌合成为抗原表位的可能性较大。综合Protean工具和BCPREDS工具的对CD96-DNAX-1蛋白的分析结果，预测其抗原表位为SDVNLTCQAQKKGLLVQMQWSKV并命名为CD96-D1。人工合成抗原表位CD96-D1，采用戊二醛法将小分子半抗原CD96-D1分别与卵清蛋白(OVA)、牛血清蛋白(BSA)偶联制备检测抗原和免疫抗原，免疫BALB/c鼠，融合并筛选杂交瘤细胞。获得2株分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞。优选1株，采用小鼠腹水诱生法制备腹水单克隆抗体并纯化，纯化后单克隆抗体浓度为1.96mg/mL。为研究CD96分子与细胞因子的分泌关系奠定基础。5、验证小尾寒羊CD96分子与TNF、IL-10、IFN-γ和IL-4的分泌关系为了解CD96分子的生物学功能，利用CD96-D1单克隆抗体刺激健康羊外周血混合淋巴细胞，发现CD96-D1单克隆抗体能刺激TNF、IL-10分泌的增加，对IFN-γ和IL-4分泌未产生影响。综上所述，本文为深入探讨CD96分子抗布鲁氏菌感染免疫机制奠定基础。