第一部分骨髓间充质干细胞特异性亲和环肽的筛选研究背景股骨头坏死是一种难治性疾病。在这种疾病的治疗方法中,组织工程学策略逐渐受到重视。组织工程的三个基本要素是支架、信号因子和种子细胞。在骨组织工程中,间充质干细胞是一种可靠的候选细胞来源。目前的金标准是骨髓来源的间充质干细胞。选择骨髓间充质干细胞作为组织工程种子细胞进行治疗的一个重要障碍是,在病理组织中,骨髓间充质干细胞活性降低,数量减少。所以,能否有效地向股骨头坏死区域募集骨髓间充质干细胞,促进其修复,一直是一个被主要关注的问题。在组织工程学治疗中,应用骨髓间充质干细胞特异性粘附配体修饰的支架材料,可以充分募集骨髓间充质干细胞。这为提高股骨头坏死的治疗效果提供了新颖的思路。噬菌体表面展示技术是我们发现细胞特异性粘附配体的强有力工具。这种技术是一种体外筛选技术。我们拟应用这种技术寻找骨髓间充质干细胞特异性亲和肽,为构建具有募集骨髓间充质干细胞功能的支架材料奠定基础。研究目的应用噬菌体表面展示技术,筛选骨髓间充质干细胞特异性亲和环肽,为后续功能性支架材料的构建提供基础。研究方法1.以C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞为靶细胞,利用噬菌体表面展示技术,筛选骨髓间充质干细胞特异性亲和环肽。2.应用荧光细胞化学和流式细胞技术验证筛选的环肽对C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞的亲和力。3.选择人及兔骨髓间充质干细胞作为研究对象,应用荧光细胞化学技术,进一步研究筛选的环肽对骨髓间充质干细胞的亲和力有无种属特异性。研究结果1.以C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞为靶细胞,利用噬菌体表面展示技术,成功筛选得到了骨髓间充质干细胞特异性亲和环肽CDNVAQSVC。2.荧光细胞化学和流式细胞技术结果显示,环肽CDNVAQSVC对C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞具有高度亲和力。3.选择人和兔骨髓间充质干细胞作为研究对象,荧光细胞化学结果显示,环肽CDNVAQSVC可以与人及兔骨髓间充质干细胞结合,无种属特异性。结论1.应用噬菌体表面展示技术,成功筛选得到了对骨髓间充质干细胞具有特异性亲和力的环肽CDNVAQSVC。2.筛选得到的环肽CDNVAQSVC可以与人、兔及小鼠的骨髓间充质干细胞结合,无种属特异性。第二部分功能性β-磷酸三钙支架的构建及其对骨髓间充质干细胞体外细胞学行为的影响研究背景组织工程学应用生物学和工程学的原理和技术,开发受损组织的功能替代物,以达到修复损伤和重建功能的目的。组织工程学的基本要素包括支架、信号因子和种子细胞。组织工程学的发展改变了传统的医学模式,为股骨头坏死等难治性疾病的治疗提供了新的思路。在组织工程中,支架被用作种子细胞的载体。两者结合促进病理组织修复。支架材料的生物相容性、生物降解性和生物活性等生物学特性尤为重要。β-磷酸三钙(β-tricalcium βhosβhate,β-TCP)是一种完全可吸收的生物陶瓷,具有良好的生物相容性和骨传导性。细胞可以在其上生长、分化和繁殖。但是,作为一种无机材料,由于其较快的降解速率和缺乏固有的生物刺激活性,β-TCP的应用受到挑战。表面修饰是改善生物材料性能的一种广泛采用的方法。因此,在该部分研究中,我们拟选择β-TCP作为支架材料,将第一部分筛选得到的骨髓间充质干细胞亲和环肽CDNVAQSVC与β-TCP结合,构建功能性β-TCP支架,赋予其募集骨髓间充质干细胞的功能,增强其修复效果。研究目的1.研究骨髓间充质干细胞亲和环肽CDNVAQSVC修饰的功能性β-TCP支架的构建方法。2.研究构建的功能性β-TCP支架对骨髓间充质干细胞粘附、伸展、增殖等体外细胞学行为的影响。研究方法1.采用吸附/冷冻干燥策略,构建骨髓间充质干细胞亲和环肽CDNVAQSVC修饰的功能性β-TCP支架;应用扫描电镜观察骨髓间充质干细胞亲和环肽分子在功能性β-TCP支架表面的吸附情况;应用共聚焦高内涵成像分析系统检测功能性β-TCP支架是否构建成功。2.利用CCK法检测功能性β-TCP支架对C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞粘附的影响,与无修饰的β-TCP支架比较。3.应用扫描电镜观察C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞在功能性β-TCP支架上的伸展状态,与无修饰的β-TCP支架比较。4.利用CCK法检测C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞在功能性β-TCP支架上的增殖情况,与无修饰的β-TCP支架比较。研究结果1.扫描电镜观察结果显示,采用吸附/冷冻干燥策略,骨髓间充质干细胞亲和环肽分子成功吸附于β-TCP表面;共聚焦高内涵成像分析系统检测显示,异硫氰酸荧光素标记的骨髓间充质干细胞亲和环肽分子吸附的β-TCP产生绿色荧光。2.细胞粘附实验结果显示,在功能性β-TCP支架上粘附的C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞的数量明显多于无修饰的β-TCP支架,差异有统计学意义(P<0.01)。3.细胞伸展实验结果显示,在功能性β-TCP支架上生长的C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞的伸展状态明显优于未修饰的β-TCP支架。4.细胞增殖实验结果显示,生长在功能性β-TCP支架上的C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞的数量随培养时间的增加而增加,差异有统计学意义(P<0.05);细胞接种支架7天后,在功能性β-TCP支架上的细胞数量明显多于无修饰的β-TCP支架,差异有统计学意义(P<0.05)。结论1.采用吸附/冷冻干燥策略,可以成功构建骨髓间充质干细胞亲和环肽CDNVAQSVC修饰的功能性β-TCP支架。2.与未修饰的β-TCP支架相比,功能性β-TCP支架可以明显促进骨髓间充质干细胞的粘附、伸展和增殖。第三部分髓芯减压术联合功能性β-磷酸三钙支架植入治疗早期股骨头坏死的实验研究研究背景股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是一种由缺血引起的骨梗死,可以导致股骨头塌陷和继发性髋关节骨关节炎,引起病人关节疼痛、关节功能障碍,是骨科领域常见的难治性疾病之一。据估计,美国每年有1万～2万例新发股骨头坏死病例,我国每年有15万～20万例新发病例,日本为2500～3000例。这种疾病是一个日益严重的世界性健康问题。股骨头坏死的进展是渐进性的,逐渐出现股骨头塌陷,最终导致髋关节继发性骨关节炎。病人最终接受全髋关节置换术治疗。股骨头坏死病人相对年轻,采用全髋关节置换术治疗,意味着这些病人需要接受1次以上的人工关节置换手术。股骨头坏死的早期诊断和早期治疗可以显著改善其自然进程,给患者保髋带来希望。磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)可以诊断无软骨下骨折的塌陷前的股骨头坏死,使得选择合适的方法治疗早期股骨头坏死,延缓疾病进展成为可能。髓芯减压术是股骨头坏死塌陷发生前一种常用的治疗方法,它能降低升高的骨内压,明显缓解疼痛症状。但是,一些学者研究认为,髓芯减压术虽然可以缓解疼痛症状,但是不能阻止病情进展。所以,目前已经出现了髓芯减压术与骨或植骨替代物相结合的治疗股骨头坏死的方法,以期增强单纯髓芯减压术的疗效。因此,在该部分研究中,我们拟采用髓芯减压术联合第二部分构建的功能性β-TCP支架植入的方法治疗早期股骨头坏死,研究该方法的治疗效果,为早期股骨头坏死的治疗提供新的思路和选择。研究目的研究髓芯减压术联合功能性β-TCP支架植入治疗早期股骨头坏死的效果。研究方法1.应用液氮冷冻法,构建兔早期股骨头坏死模型;股骨头组织切片HE染色观察早期股骨头坏死模型是否构建成功。2.分别采用单纯髓芯减压术、髓芯减压术联合无修饰的β-TCP支架植入、髓芯减压术联合功能性β-TCP支架植入,治疗兔早期股骨头坏死。通过影像学、组织学检查,评估三种方法的治疗效果。研究结果1.采用液氮冷冻法建模后4周,行股骨头组织切片HE染色,发现建模后的股骨头样本空骨陷窝数量明显多于未经处理的正常股骨头。建模后股骨头样本的空骨陷窝率>50%。表明兔早期股骨头坏死模型构建成功。2.治疗术后12周,显微CT结果显示,单纯髓芯减压术治疗组、髓芯减压术联合无修饰的β-TCP支架植入治疗组的股骨头出现不同程度的扁平、负重区塌陷,髓芯减压术联合功能性β-TCP支架植入治疗组的股骨头外形完整、光滑;髓芯减压术联合功能性β-TCP支架植入治疗组的股骨头的骨密度(bone mineral density,BMD)明显高于单纯髓芯减压术治疗组(P<0.01)和髓芯减压术联合无修饰的β-TCP支架植入治疗组(P<0.05),差异有统计学意义。3.治疗术后12周,髓芯减压术联合功能性β-TCP支架植入治疗组的股骨头样本的骨基质空骨陷窝率明显低于单纯髓芯减压术治疗组和髓芯减压术联合无修饰的β-TCP支架植入治疗组,Ⅰ型胶原及骨钙蛋白的表达量明显高于单纯髓芯减压术治疗组和髓芯减压术联合无修饰的β-TCP支架植入治疗组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论1.应用液氮冷冻法,可以成功构建兔早期股骨头坏死模型。2.髓芯减压术联合功能性β-磷酸三钙支架植入对早期股骨头坏死的治疗效果明显优于单纯髓芯减压术和髓芯减压术联合无修饰的β-磷酸三钙支架植入。