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头霉素C(cephamycin C)是由棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的一种β-内酰胺类抗生素,由于在其结构的7位含有一甲氧基,因此对β-内酰胺酶具有良好的稳定性,从而引起广泛的关注。由于棒状链霉菌主产物除了头霉素C外还包含克拉维酸等其他β-内酰胺类化合物,因此,如何在提高头霉素C产量的同时降低其他产物的含量成为目前研究的重点。本论文拟通过基因工程的方法,失活克拉维酸生物合成基因,从而构建只产生头霉素C的基因工程菌株。首先,将安普霉素抗性基因插入到棒状链霉菌pyc基因(克拉维酸生物合成的关键基因之一)片段中,得到重组质粒pBH14。通过接合转移的方法将上述质粒转入棒状链霉菌NRRL3585,利用抗性标记筛选同源双交换菌株获得基因阻断菌株NRRL3585-B1。结果显示插入失活的菌株克拉维酸生产能力大幅度下降,但同时头霉素C的生物合成也受到较大影响。然后,采用PCR的方法对pyc基因实施点突变,得到重组质粒pBH25,并将该质粒转入棒状链霉菌NRRL3585-B1,得到重组菌株。发酵结果显示重组菌株克拉维酸生产能力下降的同时头霉素C生物合成能力大幅提高。但对于重组菌株遗传稳定性研究表明,点突变pyc基因阻断突变株经多次传代后生产能力恢复至野生菌株水平,遗传稳定性不佳。使用Deletion失活的方法删除pyc基因中部15个碱基,得到重组质粒pBH35。将其转入棒状链霉菌NRRL3585-B1中,通过同源双交换菌株的筛选得到Deletion失活的阻断变株。发酵结果显示,该阻断变株合成克拉维酸的能力显著降低同时头霉素C的生产能力大幅提高。