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冠心病(coronary artery diseases, CAD)是一种常见的严重危害人们身心健康的疾病,动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是其病理生理基础,研究表明内皮功能不全及炎症反应是动脉粥样硬化形成的核心环节,但其机制尚未完全阐明。血管过氧化物酶(Vascular peroxidase, VPO)是本课题组发现并命名的一种新的过氧化物酶,其为过氧化物酶家族成员之一,与髓过氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)具有高达44.5%的同源性,二者均可催化过氧化氢(H202)(弱氧化剂)成为次氯酸(HOC1)(强氧化剂)从而发挥其生物学功能,与MPO主要由中性粒细胞和单核巨噬细胞分泌不同,VPO主要存在于血管及心肌组织中,目前已证实VPO具有两种亚型,VPO1和VP02,在血管内皮中的以VPO1表达为主。我们之前的研究证实冠心病患者血浆中VPO1浓度显著升高,且与氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)呈明显正相关。此外,VPO1基因沉默后可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡,其机制与抑制NADPH gp91phox蛋白表达,从而抑制ROS/p38MAPK/caspase-3通路有关,提示VPO1可能与AS发生发展密切相关。但目前VPO1在AS形成中的作用及机制尚不完全清楚。因此,本研究拟探讨VPO1在ox-LDL诱导的内皮功能不全及炎症反应中的作用及其机制。本研究将有助于阐明VPO1的生物学功能,为研发新的抗动脉粥样硬化药物提供理论依据。第一部分VPO1在ox-LDL诱导的内皮功能不全中的作用及机制目的：从分子细胞水平,运用转染VPO1shRNA等分子生物学技术,探讨VPO1在ox-LDL诱导的内皮功能不全中的作用及其机制。方法：实验分为两个部分：(1)研究ox-LDL诱导内皮细胞VPO1的表达。分组如下：量效实验：分为4组：对照组和不同浓度的ox-LDL组(用含50μng/ml、100μg/ml及200μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24h)。时效实验：分为8组：不同时间的对照组(不加任何干预因素,用培养基培养内皮细胞0、12、24、48h)和ox-LDL组(用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞0、12、24、48h),提取细胞总蛋白,采用western-blot方法检测细胞内VPO1的表达,采用荧光法检测细胞内HOC1水平。(2)研究VPO1基因沉默对ox-LDL诱导的内皮细胞NO/eNOS/DDAH/ADMA系统及细胞内HOCl生成的影响。分组如下：分为6组：空白对照组：用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；VPO1sh RNA组：在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型中,用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；Non-T sh RNA组：在内皮细胞中转染Non-T shRNA(非特异性sh RNA)后,用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；ox-LDL组：用含109μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；+VPO1sh RNA组：在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型中,用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；+Non-T sh RNA组：在内皮细胞中转染Non-T shRNA(非特异性sh RNA)后,用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；提取细胞上清液检测NO(氧化还原法)及ADMA含量(HPLC法),提取细胞总蛋白采用western-blot方法检测细胞内eNOS/DDAH的表达,采用荧光法检测细胞内HOCl水平。结果：(1) ox-LDL显著促进内皮细胞VPO1蛋白表达及HOCl水平。(2)与对照组相比,ox-LDL (100μg/ml)培养内皮细胞24h显著抑制内皮细胞NO生成、eNOS及DDAH表达,而VPO1基因沉默可逆转ox-LDL对内皮细胞的上述抑制作用,转染非特异性shRNA对ox-LDL的损伤作用无显著影响。VPO1基因沉默的内皮细胞或转染非特异性shRNA的内皮细胞,对细胞NO、eNOS及DDAH无显著影响。(3)与对照组相比,ox-LDL (100μg/ml)培养内皮细胞24h显著增加内皮细胞上清液中ADMA含量,促进内皮细胞内HOCl生成, VPO1基因沉默可显著降低ox-LDL诱导的ADMA及HOCl水平,而转染非特异性shRNA对ox-LDL诱导的ADMA及HOCl含量升高无显著影响。VPO1基因沉默的内皮细胞或转染非特异性shRNA的内皮细胞,对细胞ADMA及HOCl含量无显著影响。结论：(1)证实ox-LDL可显著增加内皮细胞VPO1表达；(2)成功构建VPO1基因沉默的内皮细胞模型,并首次发现VPO1调控了ox-LDL诱导的内皮细胞NO生成,其机制与HOCl/DDAH/ADMA/eNOS通路有关。第二部分VPO1在ox-LDL诱导的内皮细胞炎症反应中的作用及机制目的：探讨VPO1在ox-LDL诱导的内皮细胞炎症反应中的作用及其机制。方法：实验分为三个部分：(1)VPO1基因沉默对ox-LDL诱导的内皮细胞的ICAM-1、P-selectin、NF-κB和p38MAPK蛋白表达的影响。实验分组如下：空白对照组：用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；VPO1sh RNA组：在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型中,用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；Non-T sh RNA组：在内皮细胞中转染Non-T shRNA(非特异性sh RNA)后,用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时;ox-LDL组：用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；+VPO1sh RNA组：在成功构建稳定沉默VPO1的细胞模型中,用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；+Non-T sh RNA组：在内皮细胞中转染Non-T shRNA(非特异性sh RNA)后,用含100μg/ml ox-LDL的培养液孵育内皮细胞24小时；提取细胞蛋白采用western-blot方法检测ICAM-1、P-selectin、 NF-κB和p38MAPK的蛋白表达。(2)HOCl对内皮细胞ICAM-1和P-selectin蛋白表达的影响。分为4组：对照组和不同浓度的HOCl组(用含3μM、10μM及30μM HOCl的培养液孵育内皮细胞24h),提取蛋白,采用western-blot方法检测细胞内ICAM-1和P-selectin的蛋白表达。(3) HOCl对内皮细胞NF-κB和p38MAPK的影响。分组如下：空白对照组：用含1%小牛血清的DMEM培养液孵育内皮细胞24小时；SB203580组：加入终浓度为20μM的SB203580(p38MAPK的特异性阻断剂)孵育细胞1h后,用PBS继续孵育内皮细胞24小时；PDTC组：加入终浓度为100μM的PDTC(NF-κB的特异性阻断剂)孵育细胞1h后,用PBS继续孵育内皮细胞24小时；HOCl组：用含30μM HOCl的PBS孵育内皮细胞24小时；+SB203580组：加入终浓度为20μM的SB203580(p38MAPK的特异性阻断剂)孵育细胞1h后,用含30μM HOCl的PBS孵育内皮细胞24小时；+PDTC组：加入终浓度为100μM的PDTC (NF-κB的特异性阻断剂)孵育细胞1h后,用含30μM HOCl的PBS孵育内皮细胞24小时。采用western-blot方法检测细胞内NF-κB和p38MAPK的蛋白表达。结果：(1)与对照组相比,ox-LDL (100μg/ml)培养内皮细胞24h显著促进内皮细胞ICAM-1、P-selectin、NF-κB和p38MAPK蛋白表达,差异具有统计学意义(P<0.01)；而VPO1基因沉默可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞上述蛋白表达,转染非特异性shRNA对ox-LDL的促炎作用无显著影响。VPOl基因沉默的内皮细胞或转染非特异性shRNA的内皮细胞,对细胞ICAM-1、P-selectin、NF-κB和p38MAPK蛋白表达无显著影响。(2)3μM、10μM及30μM GOCl孵育内皮细胞24h呈浓度依赖性地增加内皮细胞ICAM-1和P-selectin蛋白表达,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。(3)用含30μM HOCl的PBS孵育内皮细胞24小时,可显著促进内皮细胞内NF-κB的蛋白表达,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01),预先给予20μM SB203580(p38MAPK的特异性阻断剂)或100μM的PDTC (NF-κB的特异性阻断剂)孵育细胞1h后,可显著抑制HOCl诱导的NF-κB蛋白表达,但预先给予100μM的PDTC孵育细胞1h后,对HOCl诱导的p38MAPK蛋白表达无明显抑制作用。结论：VPO1基因沉默后,可显著抑制ox-LDL诱导的内皮细胞炎症因子P-selectin和ICAM-1表达,其机制与抑制HOCl生成,从而抑制p38MAPK/NF-κB通路有关。