研究背景:视觉信息经由视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cells,RGCs)及其轴突汇聚形成的视神经传递至大脑的视皮层,是形成视觉的重要步骤。RGCs结构和功能的完整对视觉形成至关重要。RGCs凋亡及其轴突变性是青光眼、糖尿病视网膜病变,Leber遗传性视神经病变(Leber’s Hereditary Optic Neuropathy,LHON)等视神经退行性病变相关眼病患者视力下降甚至丧失的根本原因。RGCs属于不可再生细胞,发生凋亡之后其数量和功能丧失且不可逆,目前无特效治疗手段。在疾病发展过程中,采取措施保护RGCs,对其凋亡过程进行调控可能延缓疾病的发展,降低症状的严重程度,成为目前的研究热点。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路是目前公认的与细胞凋亡相关的信号通路,多项研究表明JNK的抑制剂在一定程度上能抑制病理状态神经细胞的凋亡,但同时也阻断了JNK在细胞、组织生长发育等生理过程中的正常功能,会带来明显副作用。内源性丝裂原活化蛋白激酶8相互作用蛋白1(Mapk8ip1或JIP1)是JNK通路上的1个支架蛋白,可与JNK、MKK7、MLK等结合,使JNK磷酸化,激活下游通路,影响细胞发育和凋亡等生理病理过程。JIP1在RGCs正常发育及外界刺激引起的凋亡过程中是否发挥重要作用,对JIP1的调控是否能对相关过程产生影响,是本研究的重点。研究目的:研究JIP1蛋白在RGCs正常发育和应激相关的急性损伤过程中发挥的作用,鉴定相应的调控机制,为探索RGCs凋亡相关眼病新的治疗方案提供理论依据。方法和结果本研究分为以下两个部分:第一部分JIP1在RGCs发育中的作用和机制研究1、分离和培养C57野生型小鼠的原代RGCs,培养的第6天用JIP1特异性探针及抗体行原位杂交和免疫荧光染色,结果显示JIP1的mRNA主要分布于RGCs的细胞质中,蛋白分布于胞体和神经突起,在轴突的顶端可见相对高表达。2、我们引入JIP1基因敲除小鼠品系,通过小鼠基因组DNA的PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对其进行鉴定。提取小鼠视网膜的mRNA和蛋白,分别行RT-PCR和WB检测,发现野生型小鼠视网膜可检测到JIP1的mRNA和蛋白,而JIP1基因敲除纯合型小鼠无相应的mRNA和蛋白表达。3、通过对小鼠视网膜铺片行TUJ1染色并计数RGCs数量、通过SD-OCT检测小鼠视网膜GCC厚度、通过视觉电生理检测小鼠PhNR幅值,发现在8-10周龄时,静息状态下,JIP1基因敲除小鼠的RGCs数量、GCC层厚度,RGCs功能与野生型小鼠相比未见明显差异。4、通过免疫荧光染色和WB检测等方法,发现在8-10周龄时,静息状态下,JIP1基因敲除小鼠TUJ1、NF200、PSD95、SYN等蛋白在视网膜中的表达部位和表达量与野生型小鼠相比未见明显差异。5、通过对小鼠视网膜切片行免疫荧光染色发现8-10周龄时,静息状态下,野生型小鼠和JIP1基因敲除小鼠的GFAP表达部位相同,通过提取视网膜行WB检测,发现JIP1基因敲除小鼠GFAP蛋白表达量显著升高。6、通过提取不同天龄小鼠视网膜蛋白行WB检测,发现:野生型小鼠出生后在P3和P7时JIP1蛋白即表现为高表达状态,随着年龄的增长表达量逐渐降低,JIP3蛋白的表达在出生后逐渐增加,到P30达到高峰。而JIP1基因敲除小鼠视网膜JIP3蛋白在P7和P14即表现为高表达状态。第二部分JIP1在RGCs损伤中的作用和机制研究1、对8-10周龄野生型小鼠玻璃体腔注射0.5μL的鱼藤酮(31.18mM),通过视网膜铺片荧光染色和视觉电生理的方法,对比未注射组及注射后1小时、24小时、3天小鼠的RGCs数量和PhNR的幅值,证实玻璃体腔注射鱼藤酮1小时后RGCs的数量和功能即出现显著的降低,注射24小时进一步降低,注射后3天与24小时未见统计学差异。2、玻璃体腔注射等量鱼藤酮或溶剂24小时后,通过对小鼠视网膜铺片行TUJ1染色并计数RGCs数量、通过SD-OCT检测小鼠视网膜GCC厚度、通过视觉电生理检测小鼠PhNR幅值。结果显示:对于野生型小鼠或JIP1小鼠,注射鱼藤酮组的RGCs数量,GCC厚度和PhNR幅值均明显低于注射溶剂组;对比两种不同基因型的小鼠,溶剂注射组上述指标未见明显差异;鱼藤酮注射组,JIP1基因敲除小鼠的RGCs数量,GCC厚度和PhNR幅值明显高于野生型小鼠。3、玻璃体腔注射鱼藤酮24小时、3天、7天之后,通过对小鼠视网膜铺片行TUJ1染色并计数RGCs数量、通过视觉电生理检测小鼠PhNR幅值。结果显示:小鼠玻璃体腔注射鱼藤酮造成急性损伤,RGCs数量和PhNR幅值显著降低,JIP1基因敲除小鼠的RGCs数量和PhNR幅值在注射后的3个时间点均高于野生型小鼠。4、野生型小鼠和JIP1基因敲除鼠,分为3组:不做处理,玻璃体腔注射等量鱼藤酮或溶剂24小时。通过TUNEL染色计数小鼠视网膜切片凋亡细胞数量,发现RGC层的凋亡指数(TUNEL阳性细胞数与DAPI阳性细胞数的比值)溶剂组与未注射组未见明显差异,鱼藤酮注射组JIP1基因敲除小鼠明显低于野生型小鼠。5、按上述方式处理小鼠后,通过对视网膜切片的pJNK行免疫荧光染色,发现未注射组及注射溶剂组小鼠的RGC层及外丛状层可见少量pJNK蛋白分布,注射鱼藤酮组节细胞层和外丛状层pJNK蛋白荧光强度明显升高,野生型小鼠升高更为明显。对小鼠视网膜总蛋白行WB检测,发现视网膜JNK磷酸化比值(pJNK/JNK)溶剂组与未注射组未见明显差异,鱼藤酮注射组明显升高,JIP1基因敲除小鼠升高程度明显低于野生型小鼠。6、按上述方式处理小鼠后,对小鼠视网膜总蛋白行WB检测,发现视网膜活化Caspase 3比值(Cleaved Caspase-3/Caspase 3)溶剂组与未注射组未见明显差异,鱼藤酮注射组明显升高,JIP1基因敲除小鼠升高程度明显低于野生型小鼠。7、离体培养野生型小鼠原代RGCs 6天,加入鱼藤酮处理12小时后行免疫荧光染色,发现JIP1蛋白主要表达于胞体。8、培养野生型小鼠和JIP1基因敲除鼠的原代RGCs,分为3组:不做处理,等量鱼藤酮或溶剂处理12小时。通过免疫荧光和WB检测,发现凋亡指数、JNK磷酸化比值、活化Caspase 3比值在溶剂组与未处理组均未见明显差异,在鱼藤酮处理组明显升高,但JIP1基因敲除小鼠原代RGCs的升高程度低于野生型小鼠原代RGCs。结论:1、证实了小鼠RGCs表达JIP1蛋白,静息状态在细胞突起末端高表达,应激状态下主要表达于胞体。2、发现单独敲除JIP1基因,对小鼠RGCs数量、功能以及突触蛋白表达影响不显著,这可能与星形胶质细胞激活、JIP3代偿等原因相关。3、验证了玻璃体腔注射鱼藤酮能建立小鼠急性视网膜损伤模型,注射后24小时损伤达最大值。4、证明了JIP1基因敲除对鱼藤酮造成的小鼠RGCs数量、功能等损伤具有保护作用。5、证实鱼藤酮造成的RGCs损伤与JIP1-JNK-caspase3-凋亡信号轴相关,敲除JIP1能够抑制相关信号传导。