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砒霜主要成分为三氧化二砷。三氧化二砷是一种新型的对抗肿瘤的药物,能够靶向诱导肿瘤干细胞凋亡的天然产物。三氧化二砷虽然可以靶向诱导肿瘤干细胞凋亡,但对心脏、肝脏和肾脏产生毒副作用明显,文献及前期研究显示:南天竹子提取物对三氧化二砷具备减毒持效作用;南天竹子中酚酸类成分为减三氧化二砷致肝肾毒性的主要成分;单一酚酸类成分减毒作用均不及总酚酸部位,显示南天竹子酚酸类成分对三氧化二砷减毒具有明显的多靶点、多途径的中医药特点。然而南天竹子总酚酸部位分离纯化工艺有待优选、南天竹子总酚酸部位化学成分有待进一步阐明。据此,开展了南天竹子总酚酸部位对三氧化二砷减毒作用相关研究。本论文分成4个部分,具体研究部分如下所示:一、南天竹子总酚酸部位制备工艺研究本实验运用福林酚酸比色法,用没食子酸作为对照品,得到南天竹子总酚酸的最佳提取工艺方式为20倍量70%乙醇回流提取3次,每次1.5 h。采用聚酰胺树脂柱色谱纯化,最优纯化条件为:上样液生药量浓度为5 mg/mL,上样体积15 mL,上样流速2 mL/min,先用3 BV体积的水除去杂质,再用3 BV体积的30%乙醇以1 mL/min的流速洗脱,得到总酚酸含量达到72.2%。二、南天竹子总酚酸部位对三氧化二砷减毒作用研究采用三氧化二砷致急性损伤模型,从生化指标及组织形态两个方面,综合评价纯化后的总酚酸部位对三氧化二砷减毒作用。生化指标显示,对比模型组,南天竹子总酚酸部位组和总提物组小鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶,尿素氮水平显著降低(P<0.01),丙二醛水平降低(P<0.05),血肌酐和超氧化物歧化酶,过氧化氢酶水平增高(P<0.05),且总酚酸部位组生化指标上总体较总提取物更优。组织形态显示,模型组部分肝细胞出现肝细胞水肿,点状坏死,典型肝血窦扩张,脂肪变性,组织可见大量炎症细胞浸润。总提物组少部分肝细胞出现水肿,少量炎性细胞浸润。总酚酸部位组少部分肝细胞水肿外,均正常。模型组部分肾小球萎缩和肾小球扩张,肾小囊腔有炎性细胞,肾小管上皮细胞肿大,部分有脱落,管腔内可见蛋白管型和细胞管型,组织间质和血管可见充血,肿胀。总提物组部分肾小管融合扩大形成较大囊腔,组织有血管充血,肾小球内毛细血管袢清晰可见,组织有少量炎症细胞浸润。总酚酸部位组肾小球和肾小管无明显病变,管腔内未见管型,肾间质稍增宽,少部分肿胀,但未显示明显的剂量依赖关系。结果提示,南天竹子总酚酸部位对三氧化二砷有减肝和肾脏毒性的作用,且减毒作用较总提取物更优。三、南天竹子总酚酸部位化学成分的分离与鉴定运用柱色谱技术对南天竹子总酚酸部位进行分离纯化,鉴定出24个酚酸类化合物,其中10个简单酚酸(1-10),8个木脂素(11-18),6个黄酮(19-24),包括没食子酸(1),原儿茶醛(2),3,4-二羟基苯乙酮(3),异香草酸(4),香草酸(5),香草醛(6),二氢咖啡酸甲酯(7),对羟基苯乙酸甲酯(8),没食子酸甲酯(9),没食子酸乙酯(10),rel-(αR,βR)-4-Hydroxy-β-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-γ,3-dimethoxybenzenepropano(11),异落叶松脂素(12),(1S,2R,3R)-1,2,3,4-tetrahydro7-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-6-methoxy3-acetate-2,3naphthalenedimethanol(13),sesquipinsapol B(14),2,3-Dihydro-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-7-methoxy-5-benzofuranpropanol(15),glochi-diobioside(16),β-D-Glucopyranoside,[1,2,3,4-tetrahydro-7-hydroxy-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-(hydroxymethyl)-6-methoxy-2-naphthal enyl]methyl(17),丁香树脂醇双葡萄糖苷(18),阿曼托黄素(19),(2R,3R)-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,4-dihydro-2H-1-benzopyran-3,5,7-triol(20),5,7,4′-三羟基黄酮(21),山奈酚-3-鼠李糖苷(22),芹菜素-4′-O-β-D-葡萄糖苷(23),cinchonain Ib(24),其中化合物4~9,11,13~17,20~24均为首次从该植物分离得到。四、南天竹子总酚酸部位定性与定量分析选择山奈酚-3-鼠李糖苷为薄层色谱鉴别的指标成分,25℃,30%~70%湿度条件下以二氯甲烷-甲醇-乙酸(10:1:0.5)作为展开剂,254nm下紫外灯观察。在同一薄层板上南天竹果实总酚酸溶液与山奈酚-3-鼠李糖苷在相同位置上,显示相同斑点且有较好的耐用性。以丁香树脂醇双葡萄糖苷为含量测定指标成分,采用高效液相色谱仪,选择SP ODS-A(4.6 mm×250 mm,5μm)型号的色谱柱;流动相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B),洗脱梯度:0 min,11%A;60 min,25%A,洗脱时间60 min,流速1 mL/min,进样量10 uL,柱温室温,检测波长210 nm的色谱条件,得其含量为6.82 mg/g。