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第一部分活动性结核患者细胞免疫功能变化的研究研究目的：评价不同结核感染状态人群外周血、结核感染病灶部位T细胞亚群分布状态,比较结核抗原特异性的免疫应答反应强度,初步探讨结核的免疫发病机制。研究方法：总计入选研究对象125例,其中活动性结核(ATB)组46例,潜伏性结核感染(LTBI)组34例,健康对照(HC)组45例。以IGRAs方法筛选LTBI患者,应用全血细胞表面染色、细胞内细胞因子染色(ICS)、流式细胞术等方法检测三组人群外周血单个核细胞(PBMC)及结核感染病灶部位——结核性胸腔积液中单个核细胞(PFMC)中的T细胞亚群分布状态；以PPD或磷酸化抗原HMBPP刺激,检测结核分枝杆菌特异性T细胞亚群功能状态,比较三组人群PBMC及ATB患者中PBMC与PFMC的T细胞亚群分布状态及抗原特异性宿主免疫应答差异。研究结果：活动性结核分枝杆菌感染时CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+、 CD3+Vγ2+Vδ2+T细胞绝对计数值在不同程度上降低,其中以CD3+CD4+T细胞降低更明显；同样,活动性结核患者CD3+CD4+T细胞对PPD抗原的特异性免疫应答反应明显低于潜伏性感染者(P=0.039)。此外,针对结核感染病灶部位的研究发现,结核性胸膜炎患者的PFMC中绝大部分细胞为CD3+T细胞,而CD3+CD4+T细胞所占比例以及CD3+CD4+T/CD3+CD8+T细胞比值明显高于PBMC;而PFMC中CD3+Vγ2+Vδ2+T细胞亚群则明显低于PBMC,因此,结核感染病变部位αβT细胞亚群在抗结核免疫反应中起着主要作用。进一步研究发现,结核感染病灶部位结核特异性CD3+IFN-γ+T细胞以CD4+T细胞为主,占79.43%。结论：活动性结核的发病与T细胞亚群增殖及保护性效应细胞因子分泌功能等受到抑制相关,尤其是CD3+CD4+T细胞功能受损可能是潜伏性感染发展为活动性结核的关键因素。第二部分活动性结核患者Foxp3+Treg细胞在抗结核免疫受损中的作用研究研究目的：评价不同结核感染状态人群外周血、结核感染病灶部位Foxp3+Treg细胞、数量及功能变化。研究方法：总计入选研究对象93例,包括ATB组42例,LTBI组18例,HC组33例。以IGRAs方法筛选LTBI患者,研究采用以流式细胞术为基础检测方法,应用全血表面染色,ICS、Realtime-PCR等方法,对三组人群的外周血和结核感染病灶部位——结核性胸膜炎患者胸腔积液单个核细胞(PFMC)中的Foxp3+Treg分布状态进行分析,并比较三组人群Treg细胞CTLA-4表达量不同,同时进一步分析ATB组Foxp3、CTLA-4、IL-10、IFN-γ、IL-2等mRNA的表达量,以验证活动性结核感染过程中Treg细胞相关因子的变化。研究结果：活动性结核分枝杆菌感染时,Foxp3+Treg细胞数量(5.91±1.86%)显著高于潜伏性感染(4.34±1.16%)和健康人群(4.62±1.43%)(分别为P=0.012和P=0.0008)。而Foxp3+Treg细胞的IL-10表达量在三组人群中无明显差别(P=0.260),提示Foxp3+Treg细胞在活动性结核的免疫应答中可能主要不是通过IL-10起作用。进一步分析发现,活动性结核分枝杆菌感染时,Foxp3+Treg细胞的CTLA-4表达量(22.85±10.90%)显著高于潜伏性感染(6.99±2.51%)和健康人群(9.54±4.48%)(分别为P<0.0001和P<0.0001)。此外,结核感染病灶部位PFMC中Foxp3+Treg细胞及其CTLA-4表达量均明显高于PBMC(分别为P=0.008和P=0.002)。结论：Foxp3+Treg细胞与活动性结核免疫负调控作用密切相关。在活动性结核的免疫应答中,Treg细胞可能不是通过IL-10等细胞因子的分泌起作用,而很可能是通过CTLA-4分子发挥其免疫负调控作用。第三部分Foxp3+Treg细胞调控结核发病的免疫机制研究研究目的：评价CTLA-4在Foxp3+Treg细胞发挥免疫负调控中的作用机制,为开发新的免疫治疗策略提供基础。研究方法：总计入选痰菌阳性初治活动性肺结核患者33例,其中男22例(66.7%),平均年龄42.4岁。主要采用以流式细胞术、Realtime-PCR和液相芯片技术(luminex)为基础检测方法,利用磁珠分选获得CD4+CD25+CD127dim/-Treg细胞和CD4+CD25-Tresp细胞,在PPD抗原刺激下将Treg与Tresp细胞以不同比例混合培养,通过ICS及CFSE淋巴细胞增殖抑制实验,检测活动性肺结核患者外周血Foxp3+Treg细胞对Tresp细胞增殖及分泌效应细胞因子的抑制作用；并且利用CTLA-4阻断剂,在体外验证CTLA-4参与Foxp3+Treg细胞抑制结核分枝杆菌特异性免疫功能的作用。研究结果：以PPD抗原刺激下,Treg可以显著抑制Tresp细胞分泌IFN-y及Tresp细胞的增殖(分别为P=0.0004和P=0.043)。而在上述培养体系中,同时加入CTLA-4阻断剂,那么Tresp细胞分泌IFN-y及细胞增殖的能力得到明显恢复(分别为P=0.0003和P=0.048)；这说明加入CTLA-4阻断剂可以去除Treg细胞的抑制功能。进一步研究证实,Tresp细胞分泌IFN-y和IL-2的mRNA表达量同样受Treg细胞抑制,而在加入CTLA-4阻断剂后明显上调；但IL-10和TGF-β水平在不同细胞培养体系中无显著变化。结论：活动性结核分枝杆菌感染时Foxp3+Treg细胞通过CTLA-4起免疫负调控作用,阻断CTLA-4通路,可部分逆转Foxp3+Treg细胞对结核分枝杆菌特异性Tresp细胞的抑制功能。因此,CTLA-4有希望成为活动性结核免疫治疗的新靶位。