前B细胞克隆增强因子(Pre-B-cell colony-enhancing factor,PBEF)基因最早是从激活的外周血淋巴细胞的cDNA文库中克隆获得。它作为B细胞早期分化的一种生长因子,可以增强IL-7和干细胞因子(SCF)促进前B细胞向B细胞转化的能力。研究发现当细胞处于增殖状态时,PBEF主要分布在胞浆,处于非增殖状态时,则主要出现在胞核内,从而认为PBEF是与细胞周期有关的细胞内蛋白。在炎症细胞因子如IL-β, TNF-α促使中性粒细胞生存期延长的过程中,细胞内PBEF表达明显增多;通过RNAi技术抑制PBEF的表达后,可以完全抵消炎性细胞因子针对中性粒细胞的抗凋亡作用。在妊娠过程中,PBEF在胎膜表面大量表达能使IL-6和IL-8表达增加,这可能在自然分娩和感染性流产中起了重要的作用。PBEF还具有烟酰胺磷酸核糖转移酶的活性,参与NAD+的生物合成,通过调节NAD+依赖蛋白脱乙酰基酶(Sir)-2的活性,促进血管平滑肌细胞的成熟。最近研究表明,PBEF具有很好的类胰岛素活性,可以降低血浆葡萄糖水平,增加机体对胰岛素的敏感性。因此,PBEF是一个具有多种重要生物学功能的蛋白,在体内许多的生理性和病理性过程中发挥着重要的作用,已成为许多医学领域中重要的研究对象。急性肺损伤(ALI)是指由心源性以外的各种肺内外致病因素所导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭。严重的ALI或ALI的最终严重阶段被定义为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。ALI/ARDS主要病理特征为肺微血管通透性增高而导致的肺泡渗出液中富含蛋白质的肺水肿及透明膜形成,并伴有肺间质纤维化。由肺内炎症细胞(如嗜中性粒细胞、巨噬细胞)和细胞因子(如IL-1β、IL-8)为主导的肺内炎症反应失控导致的肺泡毛细血管膜损伤是形成肺毛细血管通透性增高肺水肿的病理基础。目前ARDS的病死率为50-90%,究其原因,主要是由于ARDS发病机理错综复杂,迄今尚未完全阐明。我们以前通过对动物ALI的模型进行研究,发现PBEF的基因表达在血清、支气管肺泡灌洗液以及肺组织中的表达明显增加。通过对人类PBEF基因近端启动子区域的单核苷酸多态性(SNP)分析,我们发现在SNP T-1001G和C-1543T中GC单倍体ALI的发病率显著增加,报告基因分析显示SNP C-1543T中T的变异可以显著降低PBEF的转录。此外,凝血酶所引起的PBEF表达的增加以及内皮细胞屏障的功能障碍,可能是急性肺损伤发生的重要机制。综上,这些研究结果提示PBEF可能是急性肺损伤一个新的生物学标志物。本实验目的在于通过研究PBEF在IL-1β介导的肺血管内皮细胞和肺泡上皮细胞的炎症和通透性中的调节作用,进一步探讨PBEF在ALI发病中确切的分子机制。本实验研究了转录抑制剂对IL-1β刺激后的A549和HPAEC细胞中PBEF基因mRNA表达的影响;通过凝胶迁移滞后实验分析了转录因子与PBEF基因启动子区域SNP C-1535T的结合能力;将PBEF基因的cDNA和PBEF的siRNA转染到人肺腺癌上皮细胞(A549)和人肺动脉内皮细胞(HPAEC)中,观察了PBEF过表达和PBEF表达下调对细胞IL-8的分泌以及细胞通透性的影响;我们还研究了PBEF的表达对于其它的炎性细胞因子比如IL-16和CCR3基因表达的影响。为此做了以下的一些工作:1.通过蛋白免疫印迹(western blotting)的方法,对IL-1β诱导的A549细胞中PBEF蛋白表达的剂量依赖性与时间依赖性进行了分析。结果显示,IL-1β诱导A549细胞中PBEF蛋白的表达呈时间依赖性,并且在5至25 ng/ml浓度范围内,IL-1β均可使PBEF蛋白的表达显著增加。2.用转录抑制剂-放线菌素D处理IL-1β刺激后A549和HPAEC细胞,通过RT-PCR半定量的方法分析了转录抑制剂对PBEF基因mRNA表达的影响。结果显示,IL-1β可以显著增加A549和HPAEC细胞中PBEF基因mRNA的表达,这在一定程度上是由于IL-1β可以增加PBEF基因的转录所致。3.通过凝胶迁移滞后实验分析了转录因子与PBEF基因启动子区域SNP C-1535T的结合能力。结果显示,PBEF基因启动子区域C -1535T中T的变异可以改变一个未知的转录因子与PBEF基因启动子的亲和力,降低PBEF基因的转录,进而减少基因的表达。4.将PBEF基因的cDNA和PBEF的siRNA转染到A549和HPAEC细胞中,观察了PBEF过表达和PBEF表达下调对细胞IL-8表达的影响。结果显示,PBEF过表达可以显著增加IL-1β刺激后的A549和HPAEC细胞中IL-8的分泌;而PBEF的siRNA所引起的PBEF表达下调则可以显著降低IL-1β刺激后的A549和HPAEC细胞中IL-8的分泌。这些结果表明PBEF作为IL-1β所引发的炎症反应中一个重要的炎性细胞因子,通过调节IL-8的表达,在ALI的发病机制中起着重要的作用。5.将PBEF基因的cDNA和PBEF的siRNA转染到A549和HPAEC细胞中,观察了PBEF过表达和PBEF表达下调对其它的炎性细胞因子比如IL-16和CCR3基因表达的影响。结果显示,PBEF表达下调可以降低IL-1β刺激后的A549细胞中IL-16和CCR3基因mRNA表达,而PBEF过表达则可以增加IL-1β刺激后的A549细胞中IL-16和CCR3基因mRNA表达。这些结果提示PBEF可能在炎性通路中是一个重要的信号传递者或是始发者,它作为一个炎性细胞因子,可以通过调节其它的炎性细胞因子的表达,在肺部炎症反应中起着重要的作用。6.将PBEF基因的cDNA和PBEF的siRNA转染到A549和HPAEC细胞中,观察了PBEF过表达和PBEF表达下调对细胞通透性的影响。结果显示,PBEF过表达可以使IL-1β刺激后的A549和HPAEC细胞通透性分别增加44%和65%,而PBEF表达下调可以使IL-1β刺激后的A549和HPAEC细胞通透性分别降低29%和24%。这些结果表明PBEF可能在内皮细胞和上皮细胞屏障功能的调节中起着重要的作用。以上结果表明,PBEF作为IL-1β所引发的炎症反应中一个重要的炎性细胞因子在肺部炎症以及肺血管内皮以及肺泡上皮细胞屏障功能的调节中发挥着重要的功能。这为进一步了解PBEF的生物学功能和其在ALI发病中确切的分子机制以及为PBEF的临床应用提供了有价值的实验依据和线索。