内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合的动物实验目的:内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合对内镜医师来说是一项具有挑战性的技术,需要高水平的技术。内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合具有挑战性的一个非常重要的原因是胆囊很容易塌陷。为了解决这个问题,我们为内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合开发一种可回收的穿刺锚牵拉(RPAT)方法。我们使用猪模型评估并比较了内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合的RPAT方法与现有的内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合方法的成功率,安全性和结果;消化道-胆囊瘘管的形成是EUS引导下保胆取石术中内镜可以进入胆囊的关键。消化道-胆囊瘘管的闭合是EUS引导下保胆取石术结束的关键。消化道-胆囊瘘管的闭合之后的长期情况是本术式关注的重点。如果术后胆囊与消化道粘连很重,甚至持续与周围粘连严重,这一术式的意义和必要性就需要重新考量。反之,若术后胆囊与消化道以及周围组织粘连很轻甚至没有粘连,胆汁中即使出现小的结晶或沉淀,由于胆囊的的收缩功能良好,可能会把这些结晶或沉淀排出,避免形成结石;对于结石复发的患者,不论是再次行消化道与胆囊支架吻合术还是选择外科手术切除都不会产生很大影响,那么这个术式也将有着广阔的临床应用前景。因此,我们将进行内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合后胆囊-消化道瘘管形成及闭合的初步研究;胆囊炎及胆囊结石是目前临床上较为常见的疾病之一,在我国发病率逐年增加,影响人们的健康。本课题组进一步研究并报道了EUS引导下胆囊引流术及结石取出的手术方式,初步显示了此技术的可行性与安全性。EUS引导下胆囊与消化道暂时性支架吻合在建立胆囊和消化道之间的通道过程中,胆囊和消化道形成通路。消化道内部不是无菌环镜,细菌经通路进入胆囊,对胆囊内细菌微生态可能造成影响,而这些均可引发或加重胆囊炎和胆囊结石,因此有必要对行术后胆囊菌群评价及培养进行深入研究。方法:将16只巴马小型猪(15-20kg)随机分为实验组(n=8)和对照组(n=8)。可回收的穿刺锚牵拉方法在实验组中进行,并且在对照组中进行没有可回收穿刺锚的内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合。在实验组和对照组之间比较和分析手术不良事件,伤口愈合和内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合成功率;将巴马小型猪(15-20kg)采用可回收的穿刺锚牵拉方法进行消化道与胆囊暂时性支架吻合,观察消化道胆囊瘘管的形成情况。拔掉支架后,模拟胆囊取石,观察瘘管消化道侧的闭合情况,并进行解剖观察瘘管长期闭合后的情况;将未手术的巴马小型猪直接解剖的胆囊粘膜及胆汁为对照组。每只巴马小型猪支架置入术前采集的采集的胆汁及胆囊粘膜标本作为术前组,支架取出后不同时间采集的胆汁及胆囊粘膜标本作为术后组。选择胆囊功能良好的实验动物在EUS引导下穿刺并抽取胆囊胆汁,进行消化道与胆囊支架吻合,术后用内镜模拟胆囊取石,清理胆囊,并打入造影剂造影见胆囊管通畅后,然后将动物解剖取胆汁。将收集来的标本分组,进行如下实验:1、从胆囊粘膜中提取16SrDNA进行高通量测序,比较各组菌群的变化。2、从胆汁中提取16SrDNA进行高通量测序,比较各组菌群的变化。结果:所有内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合在实验组的8只动物中成功进行(8/8;100%)。然而,在对照组中,内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合仅在四头猪上成功进行(4/8;50%);其余四头猪因胆囊塌陷导致支架释放不成功,进而导致内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合失败而死亡;在瘘管形成情况方面,形成瘘管比较坚实的时间为2-4周,并且初步探索瘘管的胆囊连接处为相对薄弱位置。在瘘管闭合方面,课题组初步通过术后的胃镜检查发现,在支架拔除术后24-48小时左右瘘管口就会闭合。术后的动物解剖发现,在支架拔除术后1个月实验动物解剖时发现胆囊与消化道形成片状粘连瘢痕,但我们在支架拔除术后4个月动物解剖发现胆囊-消化道之间行成极细的瘢痕带,支架拔除术后6个月的实验动物解剖室发现实验动物胆囊-消化道吻合处光滑无粘连;胆囊粘膜菌群基于Ion S5TMXL测序平台,利用单端测序(Single-End)的方法,构建小片段文库进行单端测序。通过对Reads剪切过滤,平均每样品测得78,102条reads,经过质控平均得到73,517条有效数据,质控有效率达94.24%。以97%的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units),共得到7,057个OTUs,然后对OTUs序列与Silva132数据库进行物种注释。注释结果中,共有2,578(36.53%)个OTU注释到属水平。胆汁菌群通过对Reads剪切过滤,平均每样品测得77,458条reads,经过质控平均得到73,312条有效数据,质控有效率达94.66%。以97%的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units),共得到5,542个OTUs,然后对OTUs序列与Silva132数据库进行物种注释。注释结果中,共有2,415(43.58%)个OTU注释到属水平。术前术后胆囊粘膜的菌群在门水平上,我们发现占据主导地位的主要包括变形杆菌(Proteobacteria)、黄粉杆菌(Tenericutes)、硬杆菌(Firmicutes);在纲水平上主导的为γ-变形杆菌(Gammaproteobacteria)、Mollicutes、梭状芽孢杆菌(Clostridia);在目水平上的优势物种为黄单胞菌属(Xanthomonadales)、支原体(Mycoplasmatales)、梭状芽孢杆菌(Clostridiales);在科水平上的优势物种为黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、支原体科(Mycoplasmataceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae);在属水平上的优势物种为寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、支原体(Mycoplasma)、嗜胆菌属(Bilophila);优势种为副嗜血杆菌(Haemophilus_parasuis)、莫拉菌(Moraxella catarrhalis)。而胆汁的菌群在门水平上,我们发现占据主导地位的主要包括变形杆菌(Proteobacteria)、拟杆菌(Bacteroidetes)、硬杆菌(Firmicutes);在纲水平上主导的为γ-变形杆菌(Gammaproteobacteria)、Bacteroidia、杆菌(Bacilli);在目水平上的优势物种为肠杆菌类(Enterobacteriales)、几丁质噬菌体(Chitinophagales)、乳酸杆菌类(Lactobacillales);在科水平上的优势物种为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、几丁质噬菌体科(Chitinophagaceae)、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae);在属水平上的优势物种为肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、定会杆菌(Dinghuibacter)、嗜双胞菌(Bilophila);优势种为大肠杆菌(Escherichia_coli)、戊糖球菌(Pediococcus_pentosaceus)、假单胞菌(Pseudomonas_hibiscicola)。结论:可回收的穿刺锚牵拉方法有助于提高内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合的成功率,并可减少胆囊塌陷。因此,我们相信这种方法可以在不久的将来应用于临床的内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合。此外,可回收的穿刺锚牵拉方法将提高内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合的安全性;内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合及关闭吻合口中,消化道-胆囊瘘管牢固形成时间为2-4周,闭合时间为24-48小时,瘘管闭合后长期可变细甚至消失;实验动物在内镜超声引导下消化道与胆囊支架吻合及拔除支架后,手术前后胆囊粘膜及胆汁菌群组成发生改变,而且随着时间的增加胆囊内菌群也在发生不断地变化,但是术前术后菌群相关的导致结石活性物质无增高趋势,因此该手术对胆囊结石复发的影响可能比较小。可回收穿刺锚牵拉法应用于内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合的临床研究目的:评价可回收穿刺锚牵拉法应用于内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合对胆囊息肉、结石等胆囊疾病的治疗效果,并评价分析该方法的安全有效性。通过观察不同方法的内镜超声引导下消化道与胆囊吻合术的各项临床指标,分析该方法的安全有效性。研究方法:将2014年6月至2019年1月于我院行内镜超声引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合术的患者纳入研究。观察指标为:超声内镜引导下两种方法的吻合术操作时间的长短,吻合位置,吻合手术的成功率,术后的腹痛评分(采用视觉模拟评分法,VAS)、手术后是否有发热,有无其他术后相关的并发症发生。使用SPSS Statistics 23.0(SPSS,Inc,Chicago,Ill,USA)进行统计学分析。结果:本研究共纳入2014年6月至2019年1月期间在我院因胆囊结石、胆囊息肉等胆囊疾病行超声内镜引导下消化道与胆囊暂时性支架吻合术的治疗45例患者。男性16例,女性29例。其中进行可回收穿刺锚牵拉(RPAT)法手术的14例患者作为实验组,其中男性4例,女性10例,未使用可回收穿刺锚牵拉(RPAT)法手术的31例患者作为对照组,其中男性12例,女性19例。实验组的技术成功率100%(14/14),临床成功率100%(14/14),而在对照组技术成功率87.1%(27/31),临床成功率83.9%(26/31)。实验组发生术后发热7例,一过性白细胞升高9例,对照组发生术后发热13例,一过性白细胞升高18例。对照组术后出现并发症7例,其中腹腔感染1例,气腹2例,而实验组内均未出现。实验组术后使用抗生素天数及术后禁食时间均短于对照组(3.14d vs 4.43d,2.36d vs2.93d)。结论:综上所述,可回收穿刺锚牵拉法EUS引导下消化道与胆囊吻合术是一项安全有效、操作快捷简便,成功率高且不良事件发生率低。这种方法将来可以应用于临床的内镜超声引导下胆囊的引流。