L-天冬酰胺酶可将L-天冬酰胺侧链的酰胺基水解成天冬氨酸和氨,且在微生物中广泛存在。研究发现L-天冬酰胺酶可以减少热加工食品中致癌物——丙烯酰胺的形成,同时,对生产工艺、产品外观、风味以及营养等方面没有任何影响。此外,L-天冬酰胺酶也能够用于治疗儿童急性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤等疾病。但天然L-天冬酰胺酶的低催化活力、低热稳定性等缺陷一直限制着其在食品安全和医疗中的广泛应用。因此,寻找具有优良性质的L-天冬酰胺酶具有深远意义。本文主要针对以上问题,首先对地衣芽孢杆菌来源的L-天冬酰胺酶基因进行了克隆和异源表达,其次对重组酶进行酶学性质初步研究,最后对L-天冬酰胺酶基因进行分子改造,包括定向进化和半理性设计,并对突变酶进行了酶学性质的初步研究。旨在为L-天冬酰胺酶在食品工业化生产中的应用奠定基础。本研究结果分述如下。1.地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶基因的克隆表达。根据Genbank中地衣芽孢杆菌(Bacillus licheiforiis)的全基因组序列成功克隆出L-天冬酰胺酶基因ansZ(1131),其编码376个氨基酸,理论分子量为40kDa左右。构建重组表达载体pET-30a-Bli-ansZ,实现L-天冬酰胺酶基因ansZ在Escherichia coli中异源表达,重组酶酶活为3.97±0.16 IU/mL。纯化后重组酶酶学性质研究表明,其比活为148.83 IU/mg;最适催化反应条件为pH8.0,40℃;在pH5.0到pH10.0环境下表现出高于70%以上的残余酶活;50℃处理8 h后仍保留80%以上残余酶活;动力学参数米氏常数Km为0.692 mM,最大反应速度Vmax为1.68IU/μg。表明该重组酶其具有相对较宽的pH适应活性范围和较好的热稳定性,利于其在食品加工中的应用。2.地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的定向进化.易错PCR反应体系为dCTP、dTTP各0.2mM,Mn2+浓度0.05mM、Mg2+浓度3/5/7mM。经3轮易错PCR,从12600多个突变株中筛选出酶活最高的突变体F5A11,其酶活为8.961±0.225 IU/mL,是野生型酶酶活的2.26倍。以易错PCR筛选得到的酶活最高的前四株突变体作为亲本进行DNA Shuffling,从6500个突变文库中筛选到三株酶活提高的突变体S10、S16和S21。酶学性质研究表明,最优突变体S10,其酶活为12.648±0.351 IU/mL,是野生型酶酶活的3.19倍,纯化后比活达到306.589 IU/mg,较野生型酶比活提高106%,同时突变酶S10的Km值低于野生型酶,Kcat/Km值高于野生型酶,说明突变体酶对底物的亲和力有所增强,催化效率有所提高。三维建模分析和圆二色谱结果表明,43位突变氨基酸可能造成底物和催化中心氢键相互作用增强,67位突变氨基酸可能导致突变酶柔性增加,有利于酶与底物结合和产物的释放,进而提高酶的底物亲和力和转化效率,这可能是突变酶酶活和催化效率提高的主要原因。表明利用定向进化策略能够有效地提高地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶活性。3.地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的半理性设计。以突变体S10质粒为模板,在43位和67位分别进行饱和突变,建立突变文库,筛选后获得突变酶活力进一步提高的突变体K43Y/N67S和K43E/N67A,并通过两点组合突变技术将K43Y/N67S和K43E/N67A两个突变体组合,获得突变体K43Y/N67A。对突变体K43Y/N67S、K43E/N67A和K43Y/N67A进行酶学性质研究,结果表明,最优突变酶K43Y/N67S酶活为14.45±0.37 IU/ml,是野生型酶活的3.64倍;50℃热处理下,突变酶K43Y/N67S半衰期延长3 h。三维建模分析和圆二色谱结果表明,突变酶K43Y/N67S二级结构中α-螺旋数有所上升,突变后苯环结构的增加和疏水性作用增强可能对蛋白构象起到稳定性作用,单聚体界面柔性的增大可能有利于酶催化活性的提高。半理性设计提高了地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的酶活,热稳定性也有所改善。