肝纤维化是肝脏对各种慢性肝损伤的代偿反应所形成的肝脏瘢痕组织,主要表现为肝内细胞外基质成分(ECM)过度异常地沉积进而形成纤维化。肝纤维化是慢性肝病进一步发展为肝硬化乃至肝癌的重要病理过程,极大地威胁着人类健康。近年来,国内外学者不断探索治疗肝纤维化的方法和措施,但因其发生发展机制的复杂性,并且作用环节较多,致使临床治疗仍处在摸索阶段,迄今仍缺乏针对性强、疗效显著、毒副作用小的药物。藏药是祖国医药的宝贵财富,在肝脏疾病的治疗上有着独特的效果,治疗肝病历史悠久,具有多成分、多途径、多靶点协同作用的优势。但长期以来对其研究远滞后于中药,因此加大藏药的基础研究,从中挖掘具有较好活性的抗肝纤维化药物具有重要意义。印度牙菜,藏药名"甲蒂",为龙胆科植物印度獐牙菜Swertiachirayita(Roxb.ex Flemi)Karsten的干燥全草,具有清肝利胆,退诸热之功效,用于黄疸型肝炎,病毒性肝炎以及血热症。该药临床应用历史悠久,是治疗肝脏疾病的"蒂达"上品,亦是课题组获得二期临床批件的抗肝纤维化新药"郎庆阿塔颗粒"中的一味主要药味,然而其是否具有抗肝纤维化活性有待进一步研究,药效物质基础有待进一步阐明。因此,本课题对印度獐牙菜体内、体外抗肝纤维化活性进行了初步研究;运用代谢组学的研究方法对其抗肝纤维化可能的作用机制进行了探讨;运用UPLC-Q-TOF-MS技术对其化学成分进行了分析,初步阐明了物质基础,以希望为发掘抗肝纤维化的药物提供新途径。具体研究内容主要包括以下5个部分:1、文献研究本课题对肝纤维化的发生机制和中药治疗肝纤维化的研究进展进行了剖析;对代谢组学的研究进展进行了综合分析;对印度獐牙菜化学成分的理化性质、药效等方面的基础研究内容进行了归纳、总结。2、印度獐牙菜体内抗肝纤维化作用研究为考察印度獐牙菜对肝纤维化的防治作用,本实验采用40%CCl4/橄榄油溶液以2 mL·kg-1的剂量腹腔注射,诱导SD大鼠肝纤维化模型。造模当天开始,给药组灌胃印度獐牙菜不同部位提取药物,模型对照组与空白对照组分别灌胃等体积的生理盐水,每天1次,共8周。采用MASSON染色法观察肝组织病理学变化;采用ELISA法测定血清中肝纤维化指标透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、三型前胶原(PCⅢ)和Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)水平;采用酶法等测定血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、总胆红素(TBIL)等肝功能指标。结果表明大鼠肝纤维化模型造模成功(P<0.05),印度獐牙菜各提取物组均可显著降低CCl4致肝纤维化大鼠血清ALT、AST、ALP活性,减少HA、CIV、LN及PCⅢ含量(P<0.05),明显改善肝脏组织病变的状况,减轻肝纤维组织增生、肝细胞脂肪变性,显示印度獐牙菜有较好的防治肝纤维化作用。3、印度獐牙菜体外抗肝纤维化作用研究四氮唑蓝实验(MTT)法观察印度獐牙菜对大鼠肝星状细胞增殖的影响。实验结果表明印度獐牙菜醇提物和各提取部位组均能抑制HSC细胞的增殖,随着给药浓度的增高,抑制HSC增殖作用增强,呈现出一定的浓度依赖性。体外抗肝纤维化的实验表明印度獐牙菜具有抗肝纤维化的作用。4、印度獐牙菜抗肝纤维化血清代谢组学研究运用代谢组学方法研究肝纤维化大鼠血清代谢产物的变化。研究中运用超高效液相色谱-电喷雾四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术对正常组、肝纤维化模型组、印度獐牙菜给药组大鼠血清进行代谢图谱的鉴定分析,运用主成分分析(PCA)及偏最小二乘法—判别分析(PLS-DA)等多变量数据分析方法,寻找出模型组和对照组之间内源性标志物17个,涉及到色氨酸代谢、胆汁酸代谢等8个代谢途径,初步表明印度獐牙菜抗肝纤维化的作用机制与参与上述代谢途径有关。5、印度獐牙菜化学成分UPLC-Q-TOF-MS分析运用UPLC-Q-TOF-MS技术对藏药印度獐牙菜的化学成分进行定性分析,色谱条件为色谱柱:ACQUITY HSST3(2.1 mm × 100 mm,1.8 μm),流动相:含 0.1%甲酸的乙腈-0.1%甲酸溶液按程序梯度洗脱,流速:0.4 mL/min。质谱使用ESI离子源,正负离子模式扫描,通过精确质谱信息及元素组成分析,结合Scifinder数据库、对照品信息和相关文献,鉴定出印度獐牙菜化学成分24个,包括6个环烯醚萜、11个(?)酮、2个黄酮、2个异香豆素、2个酚类及1个三萜。总之,通过以上5个方面的系统研究,本课题从体内外证实了印度獐牙菜具有较好的抗肝纤维化作用,明确了其抗肝纤维化的代谢组学机制,初步揭示了其物质基础,为印度獐牙的深度开发利用提供科学依据,为抗肝纤维化药物的发掘提供了新途径。