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化脓隐秘杆菌(Trueperella pyogenes,T.pyogenes)是一种共生菌,主要寄生在家畜及野生动物的呼吸道、消化道和生殖道等黏膜处;同时也是一种条件性致病菌,可引起多种动物不同组织的炎症。已有研究表明,T.pyogenes具有菌毛结构,但对其菌毛的结构和功能的研究极少。菌毛作为细菌的毒力因子之一,在细菌入侵宿主的过程中发挥重要作用。因此,对T.pyogenes的菌毛进行深入研究对于全面揭示T.pyogenes的致病机制和指导T.pyogenes疫苗的开发具有积极意义。本研究克隆了T.pyogenes的三种菌毛蛋白(Fimbrial Subunit Protein,Fim)的编码基因——fim A、fim C和fim E;制备了三种重组菌毛蛋白(recombinant Fim,rFim)——rFim A、rFim C和rFim E;并分别用三种重组蛋白制备了兔多克隆抗体。应用三种多克隆抗体进行检测,我们证实只有Fim E在培养的T.pyogenes中表达。Western blot结果显示,在pH为7.5的培养环境中培养6~10 h,T.pyogenes中Fim E的表达水平达到最高;Fim E的表达不受厌氧条件的影响,但被微需氧条件抑制。试管凝集试验表明,抗rFim E多克隆抗体能引起细菌发生强烈的凝集反应,说明Fim E表达在T.pyogenes菌体表面。抗rFim C多克隆抗体能引起强烈的凝集反应,但western blot结果显示非特异性反应,因此,用现有方法难以确定T.pyogenes中Fim C是否表达。抗rFim A多克隆抗体不能引起T.pyogenes的凝集,westernblot结果显示非特异性反应,表明在本研究的培养条件下Fim A在T.pyogenes中不表达或表达不良。为了对Fim E蛋白进行深入研究,本研究制备了三株能分泌Fim E单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs)的杂交瘤细胞,分别命名为2E6、16F7和3A5,并制备了含有高浓度mAbs的腹水。Western blot结果表明,三种抗Fim EmAbs都可以与rFim E发生特异性反应,并能够与T.pyogenes菌体裂解物中一种分子量约为58 kDa的蛋白发生反应。在T.pyogenes菌体裂解物中检测到的成分,其分子量与推测的天然Fim E蛋白的分子量相符。Dot-ELISA实验结果显示,三种mAbs只与T.pyogenes菌体裂解物反应,与T.pyogenes培养上清和大肠杆菌裂解物不发生反应。上述结果表明,制备的mAbs能够与T.pyogenes的Fim E发生相对特异的结合。对三种mAbs的反应特性进行进一步分析,筛选出Fim E蛋白的两个抗原表位区,分别位于Fim E的189-277 aa和438-511 aa区域。综上,本研究证实了培养的T.pyogenes中,Fim E能够较为稳定的表达,并制备了抗Fim E的mAbs,为后续深入探讨T.pyogenes的菌毛结构及功能,提供了一定的理论依据和物质基础。