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禽流感(Avian influenza AI)是由A型流感病毒(Avian influenza virus type A)引起的一种传染性疾病,根据致病性的强弱可以分为高致病性禽流感(HPAIV)和低致病性禽流感(LPAIV)。流感病毒基因由8个片段组成,其中血凝素蛋白(HA)和神经氨酸酶蛋白(NA)是病毒的主要囊膜糖蛋白。流感病毒感染宿主始于HA蛋白和宿主细胞上的受体结合,HA蛋白主要结合两种形式唾液酸即:α-2,3唾液酸乳糖和α-2,6唾液酸乳糖。不同宿主的唾液酸的类型不同在一定程度上决定了流感病毒感染宿主的不同。迄今为止,已经发现H9N2亚型禽流感病毒不仅可以感染禽类,也可以可感染哺乳动物包括小鼠、豚鼠、雪貂、灵长类。血清学调查发现我国养殖从业人员血清中H9N2流感病毒抗体的阳性率达2.3%-13.7%,这表明H9N2亚型禽流感病毒已经获得跨越种间屏障感染哺乳动物甚至是人的能力,因而具有引发新的流感大流行的潜在威胁。H9N2亚型AIV可以为新发流感病毒提供供体,如1997年香港流行的H5N1亚型流感病毒,其内部基因可能来源于A/Quail/Hong Kong/G1/97(H9N2)分离株。2013年流行的H7N9亚型AIV的内部基因有6个来自H9N2亚型AIV。因此,加强对H9N2亚型AIV对人源受体亲和性变化的检测以及病毒对哺乳动物致病机制研究具有重要的公共卫生意义。本研究对2001-2013间分离的12株H9N2亚型禽流感病毒的HA基因进化分析发现:12株AIV尽管都属于Y-280这一大分支,但是又可以分为4个小的分支,这表明H9N2亚型禽流感病毒也在发生变异,尽管变异速度没有H5亚型禽流感那么快速。固相结合试验结果表明:不同的分离年代H9N2亚型AIV对α-2,6唾液酸受体的亲和能力存在差异,总的趋势是:随着分离年代临近,病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和能力逐渐增强,其中2013年分离株(A/Chicken/Shandong/903,简称CK/SD/903)对α-2,6唾液酸受体的亲和性最强,2006年分离株(A/Chicken/Shandong/274,简称CK/SD/274)对α-2,6唾液酸受体的亲和性最弱。通过对CK/SD/903和CK/SD/274这两个模型毒株的HA蛋白糖基化位点进行比较发现:CK/SD/903的血凝素蛋白分别在200和295位比CK/SD/274多了两个N-糖基化位点,为了验证这两个位点糖基化是否影响病毒对α-2,6受体唾液酸受体亲和性,我们构建了CK/SD/903的8质粒反向遗传操作系统,并且对CK/SD/903的血凝素蛋白的200和295位氨基酸进行突变,得到2个突变病毒。固相结合试验结果表明HA N200Q(200位由N变为Q),而HA N295Q(295位由N变为Q)可以减弱病毒对α-2,6受体唾液酸受体亲和性。为了进一步验证这两个位点的糖基化是否影响病毒对哺乳动物致病性,分别用106EID50的野毒和突变病毒(CK/SD/903(HA N200Q),CK/SD/903和CK/SD/903)攻毒6周龄小白鼠。攻毒试验结果表明:HAN200Q(200位由N变为Q)后,尽管突变病毒对小鼠的体重没有明显影响,但是可以提高病毒在小白鼠肾脏等器官复制能力(病毒基因相对表达量是野毒的936.32倍);HA N295Q(295位由N变为Q)突变后,可以提高病毒在小白鼠肝脏等器官的复制能力(病毒基因相对表达量是野毒的56倍)。本研究系统的研究了2001-2013年间的12株H9N2亚型禽流感病毒HA基因进化和病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性,结果表明:H9N2亚型流感禽流感病毒存在一定程度变异,尽管不如H5亚型流感那么明显;随着分离年代临近,病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性逐渐增强。利用反向遗传操作技术验证了903毒株HA蛋白200和295位糖基化影响病毒对α-2,6唾液酸受体的亲和性变化,并且这两个位点糖基化能够影响病毒对小白鼠组织嗜性。这为阐明H9N2亚型流感病毒跨种间传播的分子遗传机制提供重要的理论和实验依据,并且能够为H9N2亚型流感病毒感染哺乳动物或者人提供预警,因此本研究具有重要的兽医指导意义和公共卫生意义。