研究背景在许多国家,尤其是中非、西非、东亚和东南亚等非洲和亚洲国家,肝细胞肝癌(Hepatocelluar carcinoma,HCC)是导致癌症死亡的一个主要原因。通常,肝癌病人确诊时已进入进展期,且治疗后5年复发率高达30-40%。进展期肝癌病人中位生存期仅有6-8个月,而且疗效不佳。常规化疗和放疗对HCC无效。近年来,一系列血管介入治疗被应用于治疗进展期肝癌病人,但病人中位生存期并未显著延长。因此,需要采用新的治疗策略以改善HCC病人预后。研究表明,一些中药具有抗癌作用。有报道称蟾酥、黄连素、汉防己碱等中药能抑制HCC细胞增殖并诱导其凋亡。葛根作为中药被广泛应用,在东方国家也被作为食材使用。葛根含有大量异黄酮,包括葛根素、大豆黄素、大豆苷和染料木黄酮。这些异黄酮具有抗过敏、抗炎、抗病毒、抗氧化和抗肿瘤等多种功效。葛根素,化学名为4-7-二羟基-8-β-D-葡萄糖基异黄酮(C21H20O9),是从中药葛根中提取的主要有效成分之一。葛根素可能对治疗内皮细胞功能障碍、肝纤维化、神经中毒性损伤、骨损伤、酒精性肝损伤等多种疾病有效。而且,许多研究显示葛根素在动物体内具有抗肿瘤作用；体外肿瘤细胞系研究表明葛根素可抑制多种肿瘤细胞增殖并能诱导其凋亡。一项研究发现,葛根素可抑制HS578T、MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞生长,该作用具有剂量依赖性特点。来自细胞周期分布和凋亡检测研究的结果显示葛根素通过Caspase-3途径诱导细胞凋亡并使细胞停滞于G2/M期与此类似,有研究表明应用低剂量葛根素处理后RL95-2子宫内膜癌细胞内c-jun表达下调,导致芳香化酶P450表达水平下降,P450高表达子宫内膜癌细胞生长显著减慢。另外,葛根素还通过使细胞周期停滞于S期或诱导其凋亡,从而抑制急性髓性白血病和急性早幼粒白血病细胞增殖。近来,新研发出的葛根素纳米悬浮物通过降低细胞活力、诱导细胞形态学改变显示出更强的抗增殖特性。葛根素纳米悬浮物通过诱导早期凋亡从而抑制人结肠癌细胞HT-29生长。体内实验表明,与游离葛根素相比,葛根素纳米悬浮物具有更好的机体耐受性和更强的抗肿瘤活性。进一步研究还揭示葛根素对肿瘤细胞侵袭转移具有抑制作用。然而,葛根素对HCC的抗癌作用尚无报道。因此,本研究拟探讨葛根素对肝癌细胞系SMMC-7721的抗癌作用及其机制,为肝癌治疗提供新的药物。研究目的1.检测应用葛根素处理后SMMC-7721细胞活力和凋亡的变化,探讨葛根素对肝癌细胞的作用。2.测定经不同浓度葛根素处理后线粒体膜电位和细胞活性氧的变化,阐释葛根素对肝癌细胞代谢状态的影响。3.检测经不同浓度葛根素处理后SMMC-7721细胞caspase3/8/9和凋亡诱导因子(AIF)mRNA和蛋白质水平的变化,阐明葛根素对肝癌细胞作用的分子机制。4.检测应用葛根素处理不同时间后SMMC-7721田胞Akt、P38、ERK1和JNK通路蛋白磷酸化水平变化,探讨葛根素对肝癌细胞内信号通路的影响。材料与方法细胞系。人肝癌细胞系SMMC-7721购于中国科学院细胞库。细胞活力测定：MTT方法测定应用不同浓度葛根素处理12h,24h和48h后SMMC-7721细胞活力变化。应用自动化微孔板读数器测定490nm吸光度,以DMSO作为空白对照。所有样本制成5份,至少重复测定3次。细胞凋亡分析。应用Annexin-V FITC凋亡检测试剂盒检测应用不同浓度葛根素(0,500,1000,1500μg/m1)处理12h或24h后细胞凋亡,应用FACSCAN流式细胞仪计数。Hoechst染色。在Leica DM 500B荧光显微镜下观察用不同浓度葛根素(0,500,1000,1500μg/ml)处理12h或24h后凋亡SMMC-7721细胞发生的核浓缩和核碎片。线粒体膜电位(MMP)测定。应用Rhodamine 123染料测定经不同浓度葛根素(0,500,1000,1500μg/ml)处理24h后线粒体膜电位变化。应用BD FACScan进行流式细胞分析。活性氧(ROS)测定。参考文献应用流式细胞分析测定暴露于不同浓度葛根素(0,500,1000,1500μg/ml)12h后细胞ROS。应用流式细胞术(490nm激发,520nm发射)测定活性氧荧光强度。qPCR测定。分别应用0,30 (IC25),500 (IC50)或2000μg/ml(IC75)葛根素处理SMMC-7721 12h。应用TRIzo1提取处理后的细胞总RNA。取2μg总RNA应用试剂盒first strand cDNA kit按照说明进行RT-PCR。应用试剂盒SYBR Premix Ex Taq kit在ABI 7300热循环仪中首先在95℃进行预变性10分钟,接着95℃15秒,60℃ 45秒,共进行40循环扩增。各基因特异引物序列分别为；Caspase-3,5’-AACTGGACTGTGGCATTGAG-3’和5’-ACAAAGCGACTGGATGAACC-3’(扩增产物161 bp); caspase-8, 5’-CTGGGAGAAGGAAAGTTG-3’和 5’-TTGGAGAGTCCGAGATTG-3’(扩增产物184 bp); caspase-9,5’-GGAAGAGGGACAGATGAATG-3’和5’-TTGTTTGGCACCACTCAG-3’(扩增产物 242 bp)； AIF, 5-GCTACAAGCACGCTCTAACATC-3和5’-CAGCCAATCTTCCACTCACAAC-3’(扩增产物119 bp)；GAPDH,5’-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3’和 5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’(扩增产物110 bp)。应用2-AACT方法对测定结果进行相对定量分析,以GAPDH作为内参照对所有样本基因表达水平进行标准化。Western blot分析。应用500μg/ml葛根素分别处理1h,3h和6h。应用常规方法制备细胞裂解物,再用10%SDS-PAGE分离得到20gg蛋白样本,转至PVDF膜,应用含5%低脂牛奶和0.1% Tween-20缓冲液阻断后,再与小鼠抗人AKT1, p-AKT, P38, p-P38,ERK1, p-ERK1,JNK, p-JNK, AIF和 caspase-3,8,9单克隆抗体(一抗)共孵育。然后与牛抗小鼠IgG(二抗)共孵育。最后应用化学发光液显影,拍照；应用小鼠抗GAPDH单克隆抗体评估蛋白迁移,应用Lab Works Image Acquisition and Analysis Software version4.5对蛋白条带进行定量分析。统计学处理。应用SPSS16.0统计软件(SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差表示。两组间差异应用t检验,多组间差异应用单因素方差分析。所有检验均为双侧检验。设定P<0.05差异具有统计学意义。结果应用葛根素处理后SMMC-7721细胞生长受到抑制：分别用100,250,500,1000,1500和2000μg/ml葛根素处理细胞12小时后,细胞活力与对照组相比出现显著差异(0.7053±0.002963 vs 0.6943±0.002963,P=0.002；0.7053±0.002963 vs 0.69±0.002963,P=0.000；0.7053±0.002963 vs0.6053±0.002963,P=0.000：0.7053±0.002963 vs 0.5653±0.002963,P=0.000；0.7053±0.002963 vs 0.5273±0.002963,P=0.000：0.7053±0.002963 vs0.4927±0.002963,P=0.000)；继续延长处理时间发现,葛根素浓度变化对细胞活力的影响更明显：分别利用50,100,250,500,1000,1500,2000 μg/ml葛根素处理24小时,细胞活力与对照组相比具有显著差异(0.8140±0.00246 vs 0.6887±0.00246,P=0.000；0.8140±0.00246 vs0.6773±0.00246,P=0.000；0.8140±0.00246 vs 0.6580±0.00246,P=0.000；0.8140±0.00246 vs 0.5563±0.00246,P=0.000:0.8140±0.00246 vs 0.4817±0.00246, P=0.000；0.8140±0.00246 vs 0.4257±0.00246,P=0.000:0.8140±0.00246 vs 0.3690±0.00246,P=0.000)。利用相同浓度梯度(50,100,250,500,1000,1500,2000 μ g/m1)葛根素处理48小时后,细胞活力与对照组相比具有显著差异(0.9307±0.002915 vs 0.6593±0.002915,P=0.000；0.9307±0.002915 vs 0.6420±0.002915,P=0.000；0.9307±0.002915 vs 0.6220±0.002915.P=0.000； 0.9307±0.002915 vs 0.4783±0.002915, P=0.000:0.9307±0.002915 vs 0.4153±0.002915,P=0.000;0.9307±0.002915 vs 0.3747±0.002915.P=0.000; 0.9307±0.002915 vs 0.3157±0.002915,P=0.000)。应用葛根素处理后SMMC-7721细胞凋亡率显著增加,该作用具有时间依赖性和剂量依赖性特点：用较高浓度葛根素(500,1000,1500p g/ml)处理12h后,样品的凋亡水平与对照组相比具有显著差异(7.70%±0.84% vs11.77%±0.84%,P=0.001; 7.70%±0.84% vs 16.93%±0.84%,P=0.000; 7.70%±0.84% vs 20.63%±0.84%%,P=0.000);同样用浓度为500,1000,1500μ g/ml的葛根素处理24h,样品的凋亡水平与对照组相比具有显著差异(8.0%±1.08% vs 17.30%±1.08%,P=0.000；8.0%±1.08% vs 28.67%±1.08%, P=0.000;8.0%±1.08% vs 37.17%±1.08％,P=0.000)。应用葛根素处理后SMMC-7721细胞形态学变化。应用葛根素处理后的细胞比对照细胞发出更加明亮的蓝射光,提示应用葛根素处理后的细胞凋亡率增加。另外,在部分应用葛根素处理后的细胞发生了染色质浓缩,并有凋亡小体样结构形成。葛根素通过线粒体途径诱导SMMC-7721细胞发生凋亡。MMP丧失与细胞凋亡的线粒体通路激活启动有关。分别应用不同浓度(500,1000,1500 μg/m1)葛根素处理SMMC-7721细胞处理24小时可引起细胞MMP显著去极化(286961.71±4406.06 vs 194289.39±4406.06,P=0.000;286961.71±4406.06 vs 169679.15±4406.06, P=0.000; 286961.71±4406.06 vs 123012.49±4406.06,P=0.000)。该作用具有剂量依赖特点。ROS产生也与线粒体有关。分别应用不同浓度葛根素(500,1000和1500μ g/m1)处理SMMC-7721细胞12h,细胞内ROS积聚显著增加,该作用具有剂量依赖性特点(P<0.05)。当葛根素浓度为500 μ g/ml时,处理12h后与对照组相比,细胞的活性氧并无显著变化(6.17±0.515536 vs 7.29±0.515536,P=0.061)：但当葛根素浓度增加到1000 μ g/ml时,活性氧浓度变化显著(6.17±0.515536 vs13.5±0.515536,P=0.000)；葛根素浓度为1500μg/ml时,细胞的活性氧有显著变化(6.17±0.515536 vs 19.57±0.515536,P=0.000)凋亡相关基因表达水平。应用30,500,2000μg/ml葛根素处理12h后凋亡细胞占细胞总数25%,50%,75%(即IC25,IC50,IC75),SMMC-7721细胞内caspase3 mRNA的量与对照组相比有显著差异：(0.8567%±0.7631% vs 2.6633%±0.7631%,P=0.045;0.8567%±0.7631% vs 4.9867%±0.7631%,P=0.001； 0.8567%±0.7631% vs 9.4%±0.7631%,P=0.000)应用30,500,2000μg/ml葛根素处理12h后SMMC-7721细胞内caspase8 mRNA的量与对照组相比有显著差异：(1.7667%±0.8432% vs 4.9267%±0.8432%,P=0.006:1.7667%±0.8432% vs 6.6567%±0.8432％,P=0.001； 1.7667%±0.8432% vs 15.08%±0.8432%,P=0.000)。用30μg/ml葛根素处理12h后SMMC-7721细胞内caspase9 mRNA的量与对照组相比无显著差异(0.3867%±1.5079% vs 2.2167%±1.5079%,P=0.259),当葛根素浓度增加到500,2000 μg/ml时,caspase9 mRNA的量与对照组相比有显著差异(0.3867%±1.5079% vs 9.7467%±1.5079%,P=0.000；0.3867%±1.5079% vs 18.9467%±1.5079%,P=0.000)用30,500,2000 μg/ml葛根素处理细胞12h,细胞内AIF mRNA的量与对照组相比,具有显著差异(9.517%士5.9340% vs 23.36%±5.9340%,P=0.048；9.517%±5.9340% vs 34.89%±5.9340%,P=0.003；9.517%±5.9340% vs88.473%±5.9340%,P=0.000)随后,应用Western blot检测凋亡相关蛋白表达水平和各种激酶磷酸化水平。应用500μg/ml葛根素处理3h或6h后,SMMC-7721细胞内AKT,P38,ERK1和JNK磷酸化水平呈时间依赖性增加,Caspase-9和AIF蛋白表达水平上调。结论1.高浓度葛根素能够显著抑制SMMC-7721细胞增殖,该抑制作用具有时间依赖性和剂量依赖性特点。2.葛根素可通过线粒体通路诱导肝癌细胞系SMMC-7721凋亡。3.葛根素诱导SMMC-7721细胞凋亡与MMP丧失和ROS产生有关。总之,本研究表明葛根素可抑制肝癌细胞系SMMC-7721生长并可通过线粒体通路诱导其凋亡,为HCC治疗提供一个安全、有效的新选择。