免疫老化是随着年龄增长机体免疫功能逐渐衰退的过程，老年皮肤可能由于新陈代谢的减慢及免疫系统功能的异常，更易引发感染、自身免疫病及皮肤肿瘤。朗格汉斯细胞（Langerhans cell, LC）是定居于皮肤的树突状细胞（Dendritic cell, DC）亚群，是皮肤免疫反应中重要的抗原提呈细胞（Antigen presenting cell,APC），在调控皮肤免疫应答中起着非常关键的作用。LC独特的标志是胞质中含有一种网球拍型小颗粒，称为伯贝克颗粒（Birbeck granule），它参与抗原的捕获和处理。摄取抗原后的LC迁至淋巴结，将抗原呈递给T细胞，引发皮肤免疫反应，从而在对抵抗侵入皮肤的病原微生物、监视皮肤癌变细胞中发挥重要作用。随着衰老与皮肤免疫间关系研究的深入，衰老过程中LC发育和功能的变化也日益受到重视。转化生长因子β（transforming growth factorβ,TGFβ）是一类功能复杂的多肽类细胞因子超家族，Smad蛋白是TGFβ受体复合物下游的信号调节分子，可将活化信号由胞膜传导至胞核而调节转录过程。TGFβ/Smad信号转导通路是TGFβ发挥生物学作用的主要信号途径，已参与多种免疫活性细胞如T细胞、中性粒细胞及巨噬细胞的发育和功能的调控，但在LC发育和功能的作用尚不清楚。衰老不仅影响机体获得性免疫应答，固有免疫在此过程中亦发生了明显改变。目前大量研究显示，衰老时不同组织、不同部位DC亚群的数量和功能发生了变化；但表皮LC，作为定居于皮肤的DC亚群，在免疫老化过程中其功能会发生怎样的变化，目前尚不十分清楚。同时，衰老是一个多因素引发的多个器官功能下降的过程，由于基因水平改变导致的细胞蛋白水平变化已经成为此过程的重要因素之一。近几年大量研究显示：miRNA已参与机体免疫反应的生理和病理过程。产生成熟miRNA必需的核酸酶IIIDicer的敲除可使皮肤LC数量和功能明显下降，这一结果表明miRNA参与LC的发育和功能的调控。重要的是，miRNA还参与体内多种免疫细胞如巨噬细胞等的老化过程，那么它是否参与了表皮LC的老化，在此过程中与老年LC功能变化又有着怎样的关系，这需要在相应的动物模型和实验中进行深入研究。因此，本课题以研究LC发育的信号通路为切入点，利用基因敲除鼠和老龄鼠动物模型，探讨了TGFβ/Smad3信号转导通路在LC发育及功能中的作用、衰老对LC功能的影响、老年LCmiRNA表达谱的变化及其与LC功能改变的关系。本研究主要包括三部分的内容：1.Smad3在调控表皮LC发育的信号通路中的作用。首先我们使用Smad3敲除鼠模型验证TGFβ/Smad信号转导通路在LC发育中的作用。FACS分析不同年龄阶段的Smad3KO和WT小鼠表皮LC数量的变化。结果显示，与野生型小鼠（wild type, WT）相比，Smad3的缺陷对表皮LC发育在不同的年龄阶段均没有明显影响，但新生鼠（0d）表皮中LC数量最少（0.78±0.11%），且表达Langerin较低；出生后3d，Langerin的表达逐渐升高（70-80%），此时表皮LC数量亦达到一个最高峰值（2.72±0.14%）；出生5weeks后，表皮LC数量达到一个恒定水平，并保持相对稳定状态（1-2%）。免疫荧光染色观察耳朵皮片中LC的分布及MHCⅡ分子和Langerin分子的表达。与FACS检测结果相一致，新生鼠（0d）的表皮LC只表达MHCⅡ分子，不表达Langerin分子；而出生5weeks后，LC则同时表达MHCⅡ和Langerin分子。与相同年龄阶段WT小鼠相比，Smad3缺陷鼠的表皮LC细胞数量没有发生明显变化（p>0.05）。吞噬功能的强弱在一定程度上代表了DC的成熟度及功能状态，我们接着观察了Smad3对LC成熟度和吞噬抗原能力的影响。Smad3缺陷鼠表皮LC没有自发成熟，且体外培养48h后，尽管LC高表达MHCII及共刺激分子CD80、CD86，但与WT小鼠相比没有显著变化（p>0.05）。进一步分析LC吞噬抗原的能力，结果发现Smad3缺陷鼠与WT小鼠表皮LC均有很强的吞噬能力，但两者之间没有显著性差异（p>0.05）。以上结果表明，Smad3缺陷不影响表皮LC发育、成熟及吞噬能力，这提示我们TGFβ/Smad3信号转导通路不是TGFβ调控LC发育和功能必需的唯一的信号途径，在此通路中Smad2可能替代Smad3作为胞内信号蛋白介导TGFβ效应；或者TGFβ通过non-Smad蛋白信号通路在LC发育和功能中发挥生物学作用，这需要在相应的动物模型中进一步深入探讨。2.衰老对表皮LC发育和功能的影响。LC是定居于皮肤的不成熟DC亚群，在调控皮肤免疫应答中起着非常关键的作用。随着衰老与皮肤免疫间关系研究的深入，衰老过程中LC发育和功能的变化也日益受到重视。首先我们观察了不同年龄阶段小鼠表皮LC数量的变化。FACS分析结果显示，随着年龄的增长，与<6个月小鼠（1.60±0.09%）相比，12个月小鼠LC数量（1.32±0.02%）显著降低(p<0.05)，但与18个月小鼠（1.13±0.10%）比较，没有显著性差异(p>0.05)。因为表皮LC数量的减少，移行至引流淋巴结中LC数量也相应的降低，下降了2-3倍。但是表皮中γδT细胞从18个月小鼠开始显著降低，在<6个月和12个月小鼠的表皮中没有显著性差异（p>0.05）。表皮中LC数量的显著下降可能与LC自我更新能力有关，因此我们分析了代表核增殖能力的Ki67和坏死及凋亡标志的AnnxinV/7-AAD表达比例，结果发现三组间无显著性差异。这些结果提示随年龄的老化，LC数量的减少可能与局部LC前体细胞缺损或对LC祖细胞趋化能力下降有关。DC刺激T细胞活化、增殖发生免疫应答的过程需要细胞表面的MHCII和共刺激分子介导的细胞间接触，因此我们观察了衰老对表皮LC成熟度的影响。结果显示，与年轻小鼠相比，老龄小鼠表皮LC体外培养48h后，低表达MHCII、CD80及CD86分子，表明年龄老化对LC成熟有抑制作用。LC作为皮肤中与外界环境中不同物质接触的“哨兵”，能摄取、加工抗原，并迁移至局部淋巴结，刺激初始T细胞，引起皮肤免疫应答。因此，我们又检测了LC吞噬抗原和迁移能力。与年轻小鼠相比，老龄小鼠表皮LC的吞噬能力显著升高(p<0.05)。既往研究显示Langerin是LC中Birbeck颗粒的主要组成成分，其与摄取抗原能力有关，因此我们进一步分析衰老对Langerin表达的影响。结果显示，与吞噬抗原能力结果相对应，老龄小鼠LC中Langerin的表达明显上调(p<0.05)。但是，LC在体内的迁移能力，老龄小鼠和年轻小鼠之间无显著性差异（p>0.05）。DC的一个显著特点是具有刺激T细胞增殖的能力。为探讨LC的抗原提呈能力，我们将分选的LC与OTI/OTII肽特异的CD8+/CD4+T细胞共培养，观察抗原肽特异的T细胞增殖能力。结果显示，与年轻小鼠相比，老龄小鼠表皮LC刺激抗原肽特异的CD8+/CD4+T细胞增殖能力显著下降(p<0.05)。以上结果表明，衰老能导致小鼠表皮LC的数量减少、成熟度下降、吞噬抗原能力增高但抗原提呈功能缺陷，那么免疫老化过程中，导致皮肤LC发育和功能缺陷的原因是什么呢，需要我们继续探讨研究。3.探索了miRNA与老年LC功能变化的关系。既往研究显示miRNA参与老化过程中一些组织和细胞的功能调控，并且在LC的发育和功能中也发挥重要作用。为探讨miRNA是否参与对老龄小鼠LC发育和功能的调控，我们应用miRNA芯片技术进行老龄小鼠和年轻小鼠皮肤LC的miRNA表达谱研究，以期寻找老化LC特异的miRNA表达规律。结果显示，与年轻小鼠相比，老化LC的miRNA表达谱中，40个miRNAs表达明显下降，13个miRNAs表达显著上调（foldchange>3）。为验证基因芯片数据的准确性，挑选具有代表性的miR-709、miR-449等单独做实时定量PCR以验证其表达水平。同时snoRNA135及snoRNA202被用作内对照基因。结果显示，miR-709等表达变化在单个PCR中得到验证，虽然其变化幅度小于基因阵列检测结果，考虑到基因阵列与单个PCR的不同，该差异仍在可接受范围内。为进一步探讨miRNA与老年LC功能变化的关系，我们运用Target Scan Mouse6.2数据库推测变化的miRNAs调控的靶分子在老化LC发育和功能中的作用。根据miRNA-gene网络图显示：与老化相关的miRNAs调控的靶分子如TGFβ、Gfi1、IRF8、RunX3及CSF1R等均通过不同信号通路参与LC发育和功能的过程。综上所述，Smad3缺陷不影响表皮LC发育、成熟及吞噬能力，因此TGFβ/Smad3不是其发育所必需的唯一的胞内信号途径；并且随着年龄的老化，LC数量和功能明显下降，重要的是，LC的miRNA表达图谱随着年龄也发生改变。本研究从LC分化、发育的角度探讨了TGFβ/Smad3信号通路在LC发育中的作用，分析了衰老对LC发育和功能的影响，阐明了小分子RNA与老年朗格汉斯细胞功能变化的关系，这对进一步开展LC基础研究及应用其治疗人类相关疾病提供重要的理论依据。