柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing, HLB)是由韧皮部杆菌属(Candidatus liberibacter)侵染引起的一种毁灭性病害,是国内外植物检疫对象之一。该病主要分布在亚洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的近50个国家和地区,中国19个柑橘生产省(市、自治区)中已有11个受到HLB的危害,对世界柑橘产业的稳定和发展造成了严重的威胁。由于目前尚无有效防治药剂和抗病品种,主要采取加强检疫、挖除病树、防治木虱和种植无病苗木等防控措施,因此加强柑橘黄龙病的早期诊断和防治药剂筛选,对于防止黄龙病疫情扩散及有效防控尤为重要。鉴于国内学者建立的柑橘黄龙病LAMP检测体系,在结果上或无法实现可视化,或采用的可视化方法(开盖加显色指示剂)容易造成污染的问题,本研究利用钙黄绿素(Calcein)的荧光显色指示剂作用,建立了可视化的柑橘黄龙病LAMP检测体系,因Calcein在LAMP反应开始前加入,所以避免了因开盖操作而造成反应产物污染。在该方法中,以柑橘黄龙病菌16S rDNA靶序列的6个区域设计4条特异性引物(2条内引物、2条外引物),通过调整反应温度、反应时间、Mg2+、 dNTP、甜菜碱和引物的浓度,优化了LAMP反应体系和反应条件,并对其特异性和灵敏度进行验证。研究确定最佳反应温度为65℃,反应时间70min。特异性检测结果显示：柑橘黄龙病菌总DNA样品LAMP产物均为阳性(绿色),而其它9个供试样品LAMP产物均为阴性(橘黄色)；灵敏度验证结果显示：该检测体系对感染黄龙病菌的柑橘叶片总DNA的检出限为1.51×10-3ng/μL,而对阳性质粒DNA的检出限为2.12×10-6ng/μL,与实时荧光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qPCR)灵敏度相当,而比常规PCR灵敏度高1000倍。对田间采集的柑橘黄龙病疑似症状样品分别采用LAMP和qPCR体系进行检测,并比较2种检测方法的样品检出率和2种检测方法间的检测符合率,以验证可视化LAMP技术的实际应用效果。结果显示,从福建漳州、南平、福州等地区采集的30份具有柑橘黄龙病疑似症状的芦柑叶片,可视化LAMP检测技术和qPCR检测技术的检出率均为76.7%(23/30),2种检测方法间的检测符合率为100%,表明可视化LAMP检测方法快速、简便、特异、灵敏,适合于基层部门和田间使用,为柑橘黄龙病早期诊断提供了一种新的手段。由于HLB菌无法进行纯培养,导致防治药剂筛选工作进展缓慢。本文以消毒剂作为HLB防治的候选药剂开展药剂筛选试验。将染病接穗浸泡不同消毒剂后,分别嫁接到砧木上,利用qPCR技术分析不同药剂处理前后黄龙病菌浓度的变化,采用相对防效评价体系进行评价,从而建立HLB防治药剂的相对防效评价体系。结果表明,14种供试药剂中有6种药剂不适合此法；其余8种消毒剂能够有效降低接穗黄龙病菌浓度,具有较高的相对防效。其中以三氯泡腾消毒片(TCCA)中有效氯含量为1250mg/L时,相对防效最佳,达到了88.9±0.47%。由于黄龙病菌在自然条件下会随着季节的变化而发生消长现象,因此,目前只能根据相对防效对供试药剂的防治效果进行初步判断,最终的防效还需要更长时间的验证和评估。综上所述,本文以LAMP技术为基础,结合Calcein显色技术,建立了简便、快速、特异、灵敏、安全,且检测成本低的柑橘黄龙病可视化LAMP检测体系,适宜田间样品检测。另外,本文初步筛选出对HLB有效的消毒剂并建立相应的防效评价体系,为黄龙病的防治提供了参考依据和评价标准。