大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)属于我国独有且濒危珍稀的野生物种,受制于大面积栖息地碎片化和隔离小种群导致无法自然繁殖,大熊猫迁地保护工作因此尤为重要。大熊猫轮状病毒(Giant Panda Rotavirus,GPRV)感染常引起幼兽的腹泻,甚至死亡,是一种严重危害大熊猫迁地保护的疾病。轮状病毒诊断方法多样,各具优缺点,对于发生腹泻性疾病的大熊猫而言,快速且准确的区分是否轮状病毒感染所致,能为临床处置赢得宝贵的时间和提供方向性指导。近年来,实时荧光定量PCR技术(Real-time Fuorescence Quantitative PCR,qPCR)在人类重大公共卫生疫病的诊断中发挥了重大作用,被认为是极其高效的诊断方法。本研究依据GenBank中登录的GPRV VP4基因序列设计1对引物,通过对引物浓度、退火温度和循环数的优化,绘制标准曲线,建立一种能快速准确定量检测样品中的GPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法,使本方法敏感度达1.0×10~0拷贝/μL;同时通过对重组质粒各稀释度核酸样品进行常规RT-PCR检测,其敏感度可达1.0×10~2拷贝/μL。由此可见,GPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法比常规RT-PCR检测方法灵敏度高出至少100倍。利用建立的GPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法检测CDV、CPV、CAV-1和CAV-2的核酸,结果均呈阴性,表明该法特异性强,结果可靠。重复性试验显示批内及批间的变异系数(CV)均小于1%,说明该方法的重复性良好,结果稳定。因此本研究建立的GPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法可以满足对大熊猫腹泻样本的轮状病毒感染快速、准确、灵敏诊断。应用本研究建立的GPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法对227份不同时期、不同个体的大熊猫粪便进行检测,同时进行常规RT-PCR检测方法对比,2015年6月采集的A基地样品常规RT-PCR的检出率为8.1%,而实时荧光定量RT-PCR的检出率为13.5%;2011-2013年采集的B基地样品常规RT-PCR的检出率为14.3%,而实时荧光定量RT-PCR的检出率为19%,同样,2015年6月采集样品常规RT-PCR的检出率为0,而实时荧光定量RT-PCR的检出率为12%,实时荧光定量RT-PCR检测方法均表现出更好的灵敏度。同时在研究应用中发现其对做好大熊猫携带轮状病毒的疫源疫病本底调查和疾病防控都极具指导作用。因此,本研究建立的GPRV实时荧光定量RT-PCR检测方法对做好大熊猫种群健康管理,优化大熊猫对外展示,指导野化放归大熊猫选择,完善野外救护大熊猫疾病监测都具有极其重要的价值。