几种新型氨基糖苷类抗生素免疫分析方法建立及初步应用

来源 :江苏大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:iamup
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氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside antibiotics,AGs)因具备良好的抗菌活性被广泛应用于医疗、畜牧和水产等行业,其主要通过废水或废物垃圾进入环境当中,经环境介质和食物链迁移对生态平衡和人体健康造成危害。因此,探索环境中多通道、高灵敏、快速、简便的AGs检测方法就显得尤为重要。本研究以卡那霉素(Kanamycin,KAN)和链霉素(Streptomycin,STR)两种典型的氨基糖苷类抗生素为具体研究对象,制备高特异性的链霉素单克隆抗体,建立链霉素ELISA分析方法,结合新材料开发几种新型环境中KAN和STR残留检测的免疫分析方法(KAN单克隆抗体为本实验室已制备)并应用于环境样本分析。采用EDC法合成免疫原(STR-BSA)和包被原(STR-OVA),并利用单克隆抗体技术成功筛选获得5株能够稳定分泌链霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞。选取抑制效果最好的6H3D5细胞株,评估其特异性,建立链霉素ELISA检测方法。优化反应条件后,标准曲线的半数抑制浓度(Inhibition of concentration,IC50)、最低检测限(Limit of detection,LOD)和检测范围(IC20IC80)分别为2.72、0.183和0.44616.5 ng/mL。为实现多分析物同时检测,本研究以硝酸纤维素膜为载体,以KAN和STR为目标物,构建了Dual-Dot ELISA方法。在最优实验条件下,裸眼判读Dual-Dot ELISA的LOD为0.9 ng/mL(KAN)和6.25 ng/mL(STR);进一步通过ImageJ软件量化后,检测KAN和STR的LOD分别为0.09 ng/mL和1.37 ng/mL;同时与UPLC/MS分析方法进行对比,两者的检测结果具有良好的相关性,并成功应用于江苏大学环境水样的检测中。结果表明,所有样本中的STR含量都低于Dual-Dot ELISA的最低检测限,其中有4个水样含有KAN,含量在0.521.47ng/mL。基于金纳米颗粒和碳纳米管多酶颗粒,构建了高灵敏、快速的卡那霉素磁珠免疫分析方法。以KAN-HRP为信号分子和识别分子,AuNPs和MWCNTs为载体,合成Au/KAN-HRP/HRP、MWCNTs/KAN-HRP/HRP-p和MWCNTs/KAN-HRP/HRP-c三种多酶探针;并比较其催化效率MWCNTs/KAN-HRP/HRP-p>MWCNTs/KAN-HRP/HRP-c>Au/KAN-HRP/HRP;建立了基于三种多酶探针(Au/KAN-HRP/HRP、MWCNTs/KAN-HRP/HRP-c和MWCNTs/KAN-HRP/HRP-p)的高灵敏卡那霉素免疫分析方法,灵敏度分别比传统IMBs法提高2倍、15倍和37倍;并成功应用于水、土壤和牛奶中卡那霉素残留检测。结果表明,环境水样中卡那霉素的含量为0.9351.055 ng/mL,牛奶样本中卡那霉素含量在0.0960.132 ng/mL,而土壤样品中未检出卡那霉素。为了实现环境中链霉素残留的快速检测,建立基于Au@Pt纳米酶的增强型免疫层析传感器。通过一步法合成具有拟酶活性的Au@Pt纳米材料,并通过TEM对其表征;通过在Au@Pt表面偶联链霉素单克隆抗体,制备获得Au@Pt/Ab/BSA探针,并建立了基于Au@Pt纳米酶的免疫层析传感器。经条件优化后,裸眼判读LOD为1.0 ng/mL,同时通过ImageJ软件量化后,其LOD为0.9 ng/mL;利用Au@Pt的拟酶活性,采用AEC为显色底物,构建基于Au@Pt纳米酶的增强型免疫层析传感器;经条件优化后,裸眼判读LOD为0.1 ng/mL,同时量化后,其LOD为0.06 ng/mL,灵敏度比传统的胶体金的层析方法提高了约80倍。
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